控制菌检查.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2005,年,4,月,16,日星期六,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,*,药品微生物限度检查,控制菌检查,1,菌种分离鉴定流程,增菌,分纯,初步鉴别试验,革兰染色,生化试验,酶类试验,抗生素敏感性试验（用于菌种鉴定）,全面鉴定,血清分型,毒素分析,基因分型,蛋白组分析,自动化仪器分析（生化，酶学，基因序列等）,2005,年,4,月,16,日星期六,2,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,2,供试品的制备,参看药典微生物限度检查法,有抑菌活性的检品应进行预处理,稀释法,离心沉淀集菌法,3000r/min,离心,30min,，,有,不溶性沉渣先,500r/min,离心,5min,薄膜过滤法,0.45um,0.02 100ml,中和法 磺胺类,100ml,中,15ml1%,对氨基苯甲酸；砷汞，硫乙醇酸盐；洗必泰，聚山梨醇酯,80,自然沉降法 难溶于水的抗菌制剂,同时做阳性和阴性对照,了解常用的培养方法和常用培养基上各控制菌菌落特征，知道如何进行菌种分纯，以便于进行下面的试验,2005,年,4,月,16,日星期六,3,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,3,革兰染色、镜检,3.1,操作步骤,3.1.1,制片,-,过火固定，避免水冲，破坏细胞结构使染料易透过,3.1.2,结晶紫染色,-1,分,3.1.3,碘液媒染,-1,分,3.1.4,乙醇脱色,-30,秒,3.1.5,沙黄复染,-30,秒,2005,年,4,月,16,日星期六,4,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,3.2,染色结果,革兰阳性菌呈蓝紫色；革兰阴性菌呈红色。可以分别用金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌作质控株,2005,年,4,月,16,日星期六,5,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,3.3,革兰染色注意事项,3.2.1,玻片必须洁净,3.2.2,涂片菌量宜少，菌不可浓,3.2.3,新鲜培养物,3.2.4,脱色是关键,2005,年,4,月,16,日星期六,6,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,3.3,革兰染色意义,3.3.1,初步识别细菌，利于进一步鉴定,3.3.2,初步选择治疗用药物,3.3.3,与致病性相关，阳性以外毒素为主，阴性菌以内毒素为主,2005,年,4,月,16,日星期六,7,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,4,触酶试验,触酶试验不应当在含血的碟子上（用上面的菌落试验应小心）进行因为红细胞中含有触酶可能导致假阳性出现,用于检测细菌是否生成过氧化氢酶，是否利于在有氧环境中生长,细菌在有环境中代谢可以生成超氧离子和过氧化氢，具有杀菌作用，能生成触酶的菌种容易耐氧。但厌氧菌有产生触酶者，某些非厌氧菌触酶也不产生（链球菌，此试验可用于菌种鉴别）,2005,年,4,月,16,日星期六,8,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,2005,年,4,月,16,日星期六,9,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,5,氧化酶试验,5.1,试验方法：滤纸，无菌玻璃棒，,1,滴新配制的,1%,二盐酸二甲基对苯二胺试液,5.2,结果判定：,30s,，,培养物出现粉红色逐渐变为紫红色，即为氧化酶试验阳性反应。若培养物不变色或仅显粉色为阴性反应,2005,年,4,月,16,日星期六,10,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,试验阳性图示,2005,年,4,月,16,日星期六,11,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,5.3,氧化酶试验注意事项,5.3.1,试验菌落,(,苔,),必须新鲜，陈旧培养物反应不可靠,5.3.2,试验避免与铁、镍等金属接触，否则易出现假阳性。宜用玻璃棒或木棒,5.3.3,试剂宜新鲜配制，放置过久，二盐酸二甲基对苯二胺氧化变色不可用,5.3.4,反应需在有氧条件下进行，勿滴加试剂过多，以免浸泡培养物使之与空气隔绝，造成假阴性反应,5.3.5,含糖培养基上的菌落不适于做氧化酶试验，因为糖分解产酸抑制氧化酶活性,2005,年,4,月,16,日星期六,12,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,6,血浆凝固酶试验简介,主要用于金黄色葡萄球菌的鉴定,分为两大类，结合凝固酶和游离凝固酶,检测以试管法为参考方法,2005,年,4,月,16,日星期六,13,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,6,凝固酶试验操作方法,无菌试管,(10,100mm)3,支，加入血浆和,0.9%,无菌氯化钠溶液,(1,：,1),各,0.5ml,，,1,支加入被检菌的营养肉汤培养液或菌悬液,0.5ml,，,作为检品管；其余,2,支作对照管：,1,支加入金黄色葡萄球菌,CMCC(B)26003,营养肉汤培养液或菌悬液,0.5ml,作为阳性对照；另一支加入营养肉汤或,0.9%,无菌氯化钠溶液,0.5ml,作阴性对照,三管同时置,36,1,水浴或恒温培养箱，,3h,后开始检查，以后每隔适当时间观察一次，直至,24h,2005,年,4,月,16,日星期六,14,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,6,凝固酶试验的注意事项,血浆凝固酶试验应用新鲜培养物及新鲜血浆。如用陈旧培养物及血浆,(,纤维蛋白常已析出,),易导致假阴性反应,用试管法检查时，轻轻将试管倾斜，,(,动作勿大，防止江凝块摇碎,),仔细观察,试验时间过长容易导致假阴性,2005,年,4,月,16,日星期六,15,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,6,凝固酶试验的结果判定,阴性对照管血浆流动自如，阳性对照管液呈凝固状，试验管液呈凝固者为阳性反应；不凝固为阴性反应。阳性对照管和阴性对照管任何一管不符合要求时，应另制备血浆，重新试验,目前商品化的凝固酶试剂多家微生物相关制剂公司有售，试剂具有较好的稳定性、准确性,2005,年,4,月,16,日星期六,16,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,7,生化试验,细菌鉴定的传统方法，参考方法,因为针对不同菌种，选择有针对性的生化试验进行，菌种不同所作的试验不同，药品检验中常用的种类不再一一介绍，所以在以后各菌种鉴定内容当中单独讨论,所有试验都需要已知阳性和阴性的菌株作为质控菌株，定期对试剂、培养基（包括培养基的灵敏度试验）以及试验操作过程进行质控试验，保证结果解释的准确性,2005,年,4,月,16,日星期六,17,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,8,自动化仪器,优点：,包含的菌种的生物学特性测试试验种类更多，可以提高菌种鉴定的准确率,缩短菌种鉴定所需要的时间，为检品的快速检验提供保证,细菌鉴定的酶学技术以及近红外技术等其他鉴定方法应用的研究将为药品微生物鉴定提供更多的选择和便利,2005,年,4,月,16,日星期六,18,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,B-D,公司的,phenix,系统、生物梅里埃公司的,VITEK,系统等,2005,年,4,月,16,日星期六,19,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,生化鉴定,2005,年,4,月,16,日星期六,20,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,一、大肠杆菌检查法 ,2005,年,4,月,16,日星期六,21,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,1,简述,大肠杆菌即大肠埃希菌（,Escherichia,coli,），,为肠杆菌科埃希菌属的模式种。埃希菌属除大肠埃希菌外，还有蟑螂埃希菌等四个种,大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外。在药品中检出大肠杆菌，表明该样品受到人和温血动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体。为保证人体健康，口服药品必须检查大肠杆菌,大肠埃希菌除普通大肠杆菌外尚有致病性大肠杆菌、产毒性大肠杆菌、溶血性大肠杆菌、侵袭性大肠杆菌等，可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻、结膜炎等病症,2005,年,4,月,16,日星期六,22,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,2,对照用菌液,菌种为大肠杆菌（）,44102,对照菌液加入量含菌,50,100cfu,（,一般用量为,0.1ml,）,制作方法：营养琼脂斜面培养物少许，接种至,5ml,营养肉汤培养基内，,36,1,培养,18,24h,后，用,0.9,无菌氯化钠溶液稀释至,1,：,10,6,其用途：,做阳性对照,检查培养基灵敏度,2005,年,4,月,16,日星期六,23,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,3,操作步骤,2005,年,4,月,16,日星期六,24,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,3.1,增菌培养,取胆盐乳糖（）培养基,3,瓶，每瓶各,100ml,2,瓶分别加入规定量的供试液，其中,1,瓶加入含对照菌,50,100,个菌落形成单位的控制菌菌液作阳性对照，第,3,瓶加入与供试液等量的稀释剂作阴性对照,37,培养,18,24h,（,必要时可延至,48h,）。,阴性对照应无菌生长。摇匀上述,BL,增菌培养液,2005,年,4,月,16,日星期六,25,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,3.2 MUG,试验原理,4-,甲基伞形酮葡糖苷酸（,MUG,）,试验的原理,MUG,被,-,葡糖苷酸酶（,GUD,）,水解，产生荧光,实验证明,96,的大肠杆菌含,GUD,，约,10,的沙门菌属一些菌种也含有此酶。单一的,MUG,鉴别大肠杆菌其漏检率达,6,，鉴于,98,的大肠杆菌靛基质试验为阳性，故将,MUG,，,靛基质试验结合，用,EMB,琼脂平板分离，辅以,IMViC,试验，在理论上可使大肠杆菌的检出率达,99,由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍，易于观察，没有主观性，因而用,MUG,鉴定大肠杆菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测,MUG,阳性（有荧光）、靛基质阳性（玫瑰红色）,MUG,阴性（无荧光）、靛基质阴性（无色）,如,MUG,、,I,试验为阳性或阴性即可报告结果，如,MUG,与,I,试验不一致时，则需分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴别,2005,年,4,月,16,日星期六,26,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,3.2 MUG,试验操作,以灭菌吸管取供试品胆盐乳糖增菌培养液、供试品阳性对照培养液、阴性对照培养液各,0.2ml,，,分别加入,MUG,蛋白胨培养基（培养基,5.7,）管，,37,培养,4,、,24h,后，将各管置,366nm,紫外灯下观察有无蓝白色荧光，然后加欧波试液,4,5,滴于上述,MUG,管内，观察液面颜色,2005,年,4,月,16,日星期六,27,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,3.2.1 MUG,法不必分离单个菌落,除大肠埃希菌外，尚有部分志贺菌属、沙门菌属的菌株；以及少数革兰阳性球菌、杆菌和芽孢菌，其,MUG,为阳性,在,MUG,培养基成分中增加了去氧胆酸钠，可排除革兰阳性菌的干扰,志贺菌、沙门菌在胆盐乳糖培养基中较难生长，即使有生长，本法能检出。并且既然药品中不得检出大肠杆菌，更不允许检出志贺菌、沙门菌,2005,年,4,月,16,日星期六,28,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,3.2.2,试验耗材要求,配制,MUG,培养基时，务必校正,pH,值，灭菌后,pH,不得过,7.4,，否则,pH,值偏高，,MUG,分解，本身则显荧光,分装,MUG,培养基的试管应挑选，试管、蛋白胨不得显荧光,2005,年,4,月,16,日星期六,29,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,3.2.3,培养时间及干扰因素,供试品培养液接种于,MUG,培养基中的培养时间，一般在,4h,、,24h,观察是否产生荧光，如荧光很微弱，不能准确判断时，可延长培养至,48h,再观察结果,由于大肠埃希菌各菌株间的,GUD,的活性不完全相同，对底物和底物的浓度反应的差异；培养基中选择因子的影响；培养温度；,pH,的改变；大量竞争菌和样品本身物质成分的干扰等，对结果的判断亦有影响,2005,年,4,月,16,日星期六,30,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,3.2.4,结果观察,取供试品的,MUG,试验管、阳性对照管、阴性对照管同时在,366nm,紫外灯下观察，阳性对照管应有较强蓝白色荧光，阴性对照管无荧光。供试品,MUG,管是否有荧光，应仔细观察比较，或将各管调换位置（阴性管居中），适当倾斜试管。如阳性对照管荧光强烈，影响供试品管与阴性对照管的观察时，亦可移去阳性对照管,2005,年,4,月,16,日星期六,31,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,3.3 MUG,与靛基质试验结果判定,如,MUG,阳性、靛基质阴性或,MUG,阴性、靛基质阳性时，将上述供试品,BL,增菌培养液轻轻摇动，以接种环沾取,1,2,环培养液划线于,EMB,或麦康凯琼脂平板上，培养,18,24h,，,观察,EMB,或麦康凯琼脂平板有无可疑大肠杆菌菌落生长。当阳性对照的平板呈典型菌落生长时，供试品分离平板无菌落生长，或有菌落但不同于下表所列特征，可判为供试品,1g,或,1ml,未检出大肠杆菌,2005,年,4,月,16,日星期六,32,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,大肠杆菌在不同培养基上菌落形态特征 ,当阳性菌对照平板未生长或生长菌落经检查不是大肠杆菌，应研究原因，重新试验或重新制备供试液，以消除供试品抑菌成分的影响。有疑似菌落生长者，挑取可疑菌落做革兰染色、镜检、,IMViC,试验,培养基,菌落形态,曙红亚甲蓝琼脂,典型菌落呈紫黑色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，有金属光泽。非典型菌落呈浅紫色、粉红色，或菌落中心紫色或无明显暗色中心，无金属光泽。,麦康凯琼脂,典型菌落呈鲜桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。非典型菌落呈微红色，或菌落中心呈红色。,2005,年,4,月,16,日星期六,33,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,大肠埃希菌在,EMB,、,MAC,上的特征,2005,年,4,月,16,日星期六,34,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,3.4,疑似菌落的挑选,如生长菌落与上表所列特征相符或疑似者，以接种针轻轻接触单个疑似菌落的表面中心，沾取培养物，应挑选,2,3,个以上疑似菌落，分别接种营养琼脂斜面，培养,18,24h,，,作检查,无单个可疑菌落，但有可疑菌团（紫黑色，或有金属光泽），应沾取可疑菌团培养物少许，或重新取增菌培养液划线接种于,EMB,琼脂平板，培养,18,24h,，,再挑选单个疑似菌落，纯培养，作以下革兰染色、镜检以及生化试验,2005,年,4,月,16,日星期六,35,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,4,生化试验,2005,年,4,月,16,日星期六,36,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,4.1,乳糖发酵试验,操作：取营养琼脂斜面培养物，接种于乳糖发酵管，培养,24,48h,，,观察产酸（指示剂为酸性品红者为红色；指示剂为溴麝香草酚蓝者为黄色），产气（小倒管内有气泡，气泡无论大小）,假阴性的处理：为避免迟缓发酵乳糖产生假阴性，亦可接种,5,乳糖发酵管。绝大多数迟缓发酵乳糖的细菌，可于,24h,出现阳性。或适当延长培养时间,2005,年,4,月,16,日星期六,37,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,4.2,靛基质试验,（,I,）,操作：取营养琼脂斜面培养物，接种于蛋白胨水培养基，培养,24,48h,，,沿管壁加入欧波试液数滴，轻轻摇动试管，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性,说明：,98,的大肠杆菌靛基质试验为阳性。,阴性培养物的进一步检查：一般,24h,即可出现阳性结果，以无菌操作先从管中取出,1,或,2ml,培养液进行检查，如靛基质是阴性，余下的蛋白胨水培养物再培养,24h,，,作试验,2005,年,4,月,16,日星期六,38,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,4.3,甲基红试验（）,操作：取营养琼脂斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养,48,2h,，,于培养液中加入甲基红指示液,2,3,滴（约每,ml,培养液加指示液,1,滴），轻微摇动，立即观察,结果观察：呈鲜红色或桔红色为阳性，呈黄色为阴性。,2005,年,4,月,16,日星期六,39,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,4.4,乙酰甲基甲醇生成试验,（,V-P,）,操作：取营养琼脂斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养,48,2h,，于,2ml,培养液中加入,-,萘酚乙醇试液,1ml,，,混匀，再加,40,氢氧化钾试液,0.4ml,，,充分振摇，在,4h,（,通常在,30min,）,内观察结果,结果观察：出现红色应判为阳性，无红色反应为阴性,2005,年,4,月,16,日星期六,40,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,4.5,枸橼酸盐利用试验,（,C,）,操作：取营养琼脂斜面培养物，接种于枸橼酸盐培养基斜面上，培养,2,4,天,结果观察：培养基斜面有菌苔生长，培养基由绿色变为蓝色时为阳性，培养基颜色无改变、无菌苔生长为阴性,注意事项：枸橼酸盐利用试验培养时间，原订为,2,天，根据试验资料，发现培养,3,天后，枸橼酸盐利用试验产生阳性。仅培养,2,天是不够的，故试验培养时间改为,2,4,天,2005,年,4,月,16,日星期六,41,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,5,结果判断,5.1,当阴性对照试验呈阴性，阳性对照试验,MUG,呈阳性，供试品,MUG,阳性、靛基质阳性，报告,lg,或,1ml,供试品检出大肠杆菌。,MUG,阴性、靛基质阴性，报告,lg,或,1ml,供试品未检出大肠杆菌,5.2 MUG,阳性、靛基质阴性、,IMViC,试验为,-+-,、革兰阴性杆菌，报告,lg,或,1ml,供试品检出大肠杆菌；,MUG,阴性、靛基质阳性、,IMViC,试验为,+-,、革兰阴性杆菌，报告,lg,或,1ml,供试品检出大肠杆菌,5.3,供试品培养物检查不符合上述二项中的任一项，报告,lg,或,1ml,供试品未检出大肠杆菌,2005,年,4,月,16,日星期六,42,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,5,结果判断,-,不能直接得出结论,5.4,当阴性对照有菌生长或阳性对照未生长或生长菌落不是大肠杆菌，不能作出检验报告。,2005,年,4,月,16,日星期六,43,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,6.,注意事项,试验操作应当严格按照相关要求进行,2005,年,4,月,16,日星期六,44,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,6.1,IMViC,试验的顺序,以灭菌接种针沾取菌苔，首先接种于枸橼酸盐琼脂斜面上，然后接种于蛋白胨水培养基、磷酸盐葡萄糖胨水培养基中。切勿将培养基带入枸橼酸盐琼脂斜面上，以免产生假阳性结果,2005,年,4,月,16,日星期六,45,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,6.2,阳性对照试验的操作环境,阳性对照试验是检查供试品是否有抑菌作用及培养条件是否适宜。阳性对照菌液的制备、计数及加入含供试品的培养基中等操作，不能在检测供试品的无菌室或净化台上进行，必须在单独的隔离间或净化台操作，以免污染供试品及操作环境,2005,年,4,月,16,日星期六,46,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,6.3,关于复验,在各类供试品中检测大肠杆菌及其他控制菌，按一次检出结果为准，不再抽样复验。检出的大肠杆菌及其他控制菌培养物须保留,1,个月，备查,2005,年,4,月,16,日星期六,47,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,大肠菌群的检查,大肠菌群的检查与大肠杆菌有相似之处，应当将分纯的菌种进行大量的生化试验来区分菌种。利用乳糖产酸产气者进行进一步鉴别,2005,年,4,月,16,日星期六,48,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,大肠菌群菌落形态特征,菌落疑似者再进行确证试验,菌落接种到胆盐乳糖发酵管，产酸产气报告检出大肠菌群，否则判未检出,培养基,菌落形态,曙红亚甲蓝琼脂,呈紫黑色、紫红色、红色或者粉红色，圆形，扁平或稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润。,麦康凯琼脂,呈鲜桃红色或者粉红色，圆形，扁平或稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润。,2005,年,4,月,16,日星期六,49,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,大肠菌群数的推算,各供试品量的检出结果,可能的大肠菌群数,N,（,cfu/g(ml,),0.1g(0.1ml),0.01g(0.01ml),0.001g(0.001ml),+,+,+,10,3,+,+,-,10,2,N10,3,+,-,-,10N10,2,-,-,-,10,2005,年,4,月,16,日星期六,50,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,二、沙门菌检查法 ,2005,年,4,月,16,日星期六,51,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,1,简述,肠杆菌科的重要致病菌,2003,年出版的第八版的临床微生物手册将沙门菌属分成两个菌种。迄今已发现,2501,个血清型,O,抗原抗血清的,A-F,群包含了分离株的,95,以上，所以用沙门菌,A-F,O,多价血清进行初筛试验,药品中的沙门菌，是以鉴定沙门菌属为准，即对每,g(,或,ml),药品中是否检出沙门菌作出检验报告。由于沙门菌血清型繁多，各血清型的生化,及血清学,特性虽密切相关，却不尽相同，采用一种增菌培养基和两种分离培养基，不可能涵盖所有沙门菌的最适增菌及分离条件,2005,年,4,月,16,日星期六,52,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,1.1,药物对沙门菌的影响,此外，由于药品在生产过程中，常受到加热、干燥等加工步骤的影响，药品中污染的沙门菌可受到损伤或呈休眠状态，故须在增菌培养前先进行预增菌。然后再进行增菌及分离、三糖铁琼脂初步鉴别、生化试验、血清学试验等步骤。其他控制菌也可能存在相同状况,2005,年,4,月,16,日星期六,53,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,2,对照用菌液,乙型副伤寒沙门菌,CMCC(B),50094,的营养琼脂,斜面培养物少许，接种至,5ml,营养肉汤培养基内。,36,1,培养,18,24h,后，用,0.9%,无菌氯化钠溶液释至,1,：,10,6,，浓度相当于,50-100,个,cfu/0.1ml,2005,年,4,月,16,日星期六,54,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,3,操作方法,2005,年,4,月,16,日星期六,55,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,3.1,增菌培养,3.1.1,预增菌 取营养肉汤培养基,3,瓶，每瓶各,100ml,，,2,瓶加入,1,：,10,供试液各,10ml,，,其中,1,瓶加入对照菌液,0.1ml(,含菌量为,50,100,个,cfu,/ml),作阳性对照，第,3,瓶加入稀释剂,10ml,作阴性对照，培养,18,24h,后观察。摇动阴性对照瓶后应清亮透明，无菌生长，否则试验无效,3.1.2,增菌培养 轻微摇动供试品增菌培养瓶及阳性对照培养瓶，分别吸取,1ml,各接种于,1,管四硫磺酸钠亮绿培养基中，培养,18,24h,。,阳性对照管应呈现混浊,2005,年,4,月,16,日星期六,56,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,3.2,分离培养,轻微摇动供试品增菌培养瓶和阳性对照增菌培养瓶，以接种环分别,沾取,1,2,环培养液接种于胆盐硫乳琼脂,(DHL),或沙门菌志贺菌琼脂,(SS),平板及曙红亚甲,蓝,(EMB),琼脂或麦康凯琼脂平板各,1,个，倒置培养,24,48h,。,检查平板上有无疑似沙门菌菌落,2005,年,4,月,16,日星期六,57,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,3.3,沙门菌在分离平板上的菌落形态特征见表,平板,沙门菌属亚属,沙门菌亚属,胆盐硫乳琼脂,(DHL),无色或微带橙色，透明或半透明，边缘整齐、光滑、中等大小或较小，产,H,2,S,的菌落中心或几乎全黑色,发酵乳糖的菌株菌落为粉红色，中心带黑色，迟缓发酵乳糖或不发酵乳糖的菌株菌落与亚属,同,沙门菌属志贺菌属琼脂,(S.S),无色或微带粉色，透明或半透明，边缘整齐、光滑，中等大小或较小，产,H,2,S,的菌落，中心呈黑色。同一平板上常有多数菌落无黑色中心,同胆盐硫乳琼脂平板。但发酵乳糖无黑色中心的菌落与大肠埃希菌不能区别,曙红亚甲蓝琼脂,(EMB),无色或微带橙色，透明或半透明，中等大小，边缘整齐光滑,发酵乳糖的菌株菌落为紫色。迟缓发酵乳糖或不发酵乳糖的菌株与沙门菌亚属,同,麦康凯琼脂,(,MacC,),同曙红亚甲蓝琼脂平板,发酵乳糖的菌株菌落为粉红色，不发酵乳糖或迟缓发酵乳糖的菌株与沙门菌亚属,同,2005,年,4,月,16,日星期六,58,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,3.3.1,菌落特征补充,由于沙门菌不发酵乳糖和蔗糖，不产酸，菌落不着色，一般为无色半透明，多数沙门菌因产生,H,2,S,，,菌落中心呈现黑色甚至全黑色，在,DHL,琼脂平板上较为明显,在,SS,琼脂平板上，,H,2,S,特征有时不明显，沙门菌属亚属,因多数菌株发酵乳糖，故在上述平板上的乳糖发酵菌落呈现粉红或紫色，但由于产生,H,2,S,，,在有,H,2,S,指示系统的平板上仍出现黑色中心,在上述培养基上，有些非沙门菌属细菌，也可呈现类似沙门菌菌落形态，须进一步鉴别,阳性对照平板上，应有沙门菌落形态特征的菌落生长，否则，应查明原因。若为供试品抑菌成分所致，须重新制备供试液，消除抑菌成分影响后再行检查,由于药物的影响或非典型菌株的存在，沙门菌菌落可呈现非典型形态，如色泽变深，菌落粗糙等，应注意辨别,2005,年,4,月,16,日星期六,59,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,3.3.2,菌落与结果报告,如阳性对照平板有典型菌落生长，供试品平板均未生长或无疑似菌落生长，则报告,1g,或,1ml,供试品未检出沙门菌,2005,年,4,月,16,日星期六,60,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,3.3.3,菌落传纯,从每个供试品的分离平板上挑取,2,3,个疑似菌落,(,无色或微带橙色，产,H,2,S,的菌落；无色或微带橙色、不产,H,2,S,的菌落；红色，产,H,2,S,的菌落,),分别接种于三糖铁琼脂斜面，接种时应以接种针轻轻接触单个菌落中心部位，沾取培养物划线于三糖铁琼脂斜面（或者克氏双糖铁琼脂斜面，制备可以查阅相关工具书）并穿刺到底层或先穿刺底层再划线斜面，培养,24,2h,，,观察结果,2005,年,4,月,16,日星期六,61,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,4,生化试验,2005,年,4,月,16,日星期六,62,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,4.1,三糖铁琼脂反应,疑似沙门菌在三糖铁琼脂斜面上的反应,斜面红色,(,产碱,),，底层黑色,(,产,H,2,S),并显示黄色,(,产酸,),；,斜面红色，底层黄色；,斜面黄色，底层黑色，并显示黄色。,多数沙门菌在三糖铁琼脂上产生气体，使底层琼脂出现气泡或使琼脂断裂，但也有不产生气体的菌种。,对在三糖铁琼脂斜面黄色并同时底层无黑色，或斜面及底层均为红色者可以排除沙门菌。,2005,年,4,月,16,日星期六,63,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,2005,年,4,月,16,日星期六,64,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,有关细菌在三糖铁琼脂上的反应,2005,年,4,月,16,日星期六,65,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,4.2,脲酶试验,用接种环沾取少许培养物，划线接种于脲琼脂斜面，培养,4,及,24h,，,观察结果。红色为阳性反应，沙门菌属为阴性反应，与变形杆菌相区别,2005,年,4,月,16,日星期六,66,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,4.3,氰化钾试验,将培养物先接种至营养肉汤培养基中培养,24h,，,用接种环沾取培养液,1,环，接种至氰化钾培养基内，另取一环培养液接种于不含氰化钾的同样培养基内作对照管，接种后即以橡胶塞塞紧，培养,24,48h,，,观察结果。对照管内有菌生长,(,混浊,),，而试验管也有菌生长为阳性反应；对照管有菌生长,(,混浊,),而试验管无菌生长,(,清亮,),为阴性反应。沙门菌应为阴性反应,2005,年,4,月,16,日星期六,67,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,4.3.1,氰化钾试验注意事项,本试验应十分注意密封管口，夏天分装培养基宜在冰浴中进行，防止氰化钾分解，产生氢氰酸逸出，致使培养基内氰化钾浓度降低，不能抑制细菌生长，造成假阳性。氰化钾为剧毒品、操作时须谨慎，切勿用口吸液。用后的培养基每管加数粒硫酸亚铁和,20%,氢氧化钾,0.5ml,去毒。然后再灭菌、洗涤,2005,年,4,月,16,日星期六,68,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,4.4,赖氨酸脱羧酶试验,用接种环沾取少许培养物，接种在赖氨酸脱羧酶培养基中，同时接种一支不含赖氨酸的同样培养基作为对照管，培养,24,48h,观察结果。对照管黄色,(,产酸,),，试验管呈紫色为阳性反应,(,赖氨酸脱羧产碱,),；试验管黄色为阴性反应。沙门菌应为阳性反应,2005,年,4,月,16,日星期六,69,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,4.5,动力试验,用接种针沾取培养物，穿刺接种于半固体营养琼脂管中，培养,24h,，,观察结果。有动力的细菌能在穿刺线以外的培养基内扩散生长使培养基呈混浊现象；无动力的细菌仅能沿穿刺线生长，不向外扩散，培养基仍呈清晰透明状；无动力表现的培养物，应在室温保留,2,3,天后，再行观察。沙门菌除鸡雏沙门菌及无动力的变种外，均具有周身鞭毛，能运动,2005,年,4,月,16,日星期六,70,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,4.6,靛基质试验,用接种环沾取少许培养物，接种到蛋白胨水培养基中，照大肠杆菌检查法靛基质试验项下操作、判断结果。沙门菌应为阴性反应,2005,年,4,月,16,日星期六,71,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,5,血清学凝集试验,2005,年,4,月,16,日星期六,72,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,5.1,取血清,准备,1,片洁净的灭菌载玻片，在近中央的一端，以直径,3mm,接种环沾取,0,多价,1,血清,2,3,环制成与玻片横径相垂直的条形涂沫，长约,1.5cm,，,宽约,0.5cm,2005,年,4,月,16,日星期六,73,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,5.2,取培养物,用接种环挑取三糖铁琼脂斜面或营养琼脂斜面的新鲜培养物少许，在血清中混匀。菌量要适当，勿过浓,2005,年,4,月,16,日星期六,74,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,5.3,凝集反应的观察,将玻片前后倾斜数次，以暗色背景衬底，在良好的照明条件下进行观察，任何程度的凝集现象都是阳性反应。阳性反应通常,在,3min,内发生。有时因血清效价低、反应迟缓时，应将玻片置培养皿内，并放一个湿棉球在旁边，盖上皿盖，经约,20min,，,再观察结果,2005,年,4,月,16,日星期六,75,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,5.4,凝集试验的对照,对出现凝集现象的待检培养物，应以,0.9%,无菌氯化钠溶液代替血清，与培养物混匀作对照试验，对照应无凝集现象，方可按阳性反应报告,2005,年,4,月,16,日星期六,76,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,5.5,凝集试验的结果判定,如试验及对照试验均出现凝集现象为非特异反应，须对该菌株培养物进行处理后再作凝集试验,当培养物与,0,多价,1,血清未出现凝集现象时，应以接种环取上述斜面培养物，置于含少量,0.9%,无菌氯化钠溶液的试管中，制成浓菌悬液，在,100,水浴中保温,30min,，,以除去可能存在的,Vi,抗原，待冷后再以此处理后的菌悬液与沙门菌,0,多价,1,血清按上法作凝集试验。如出现凝集，仍判为阳性反应；如不出现凝集现象，则为阴性反应,2005,年,4,月,16,日星期六,77,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,6.,结果判断,2005,年,4,月,16,日星期六,78,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,6.1,直接报告结果,6.1.1,供试品培养物为革兰阴性杆菌，三糖铁琼脂反应及生化反应符合沙门菌属反应，沙门菌属,0,多价,1,血清凝集试验阳性反应,(,含待检培养物经,10030min,处理后凝集试验为阳性反应,),，报告,1g,或,1ml,供试品检出沙门菌。有条件者，应进一步作菌型鉴定,6.1.2,供试品培养物三糖铁琼脂反应或生化反应不符合沙门菌属反应及沙门菌属,0,多价,1,血清凝集试验为阴性反应,(,含待检培养物经,10030min,处理后凝集试验为阴性反应,),，报告,1g,或,1ml,供试品未检出沙门菌,2005,年,4,月,16,日星期六,79,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,6.2,不能直接报告,供试品培养物出现下列情况应继续鉴定或保留菌种送交有关单位鉴定后，再作报告,6.3.1,供试品培养物生化反应符合沙门菌属反应，沙门菌属,0,多价,1,血清凝集试验阴性反应,6.3.2,供试品培养物生化反应不符合沙门菌属反应，沙门菌属,0,多价,1,血清凝集反应呈阳性反应,2005,年,4,月,16,日星期六,80,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,7,注意事项：,2005,年,4,月,16,日星期六,81,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,7.1,培养基的要求,试验用培养基，需经过质量鉴定，用已知典型反应菌株进行测试，其灵敏度及特征性反应应符合要求。培养基需在规定条件保存，在规定时间内使用。分离平板在使用前应置,36,温箱内倒置孵育,1,2h,，,使其表面温暖湿润，利于分离,2005,年,4,月,16,日星期六,82,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,7.2,防止形成气溶胶,在对供试品进行测试的同时，需做阳性菌对照及阴性对照。阴性对照应无菌生长，阳性对照应显示阳性结果，否则检验结果无效。在进行阳性菌对照试验时，应与供试品检验分开操作，避免污染。特别是用接种环沾取菌液进行接种或分离时，避免动作过大，形成气溶胶，污染供试品检验用具及操作环境,2005,年,4,月,16,日星期六,83,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,7.4,培养物的纯度,生化试验及血清学试验的被鉴定培养物必须是纯培养物，否则，不可能得到正确结果。如遇血清学凝集试验阳性时而生化试验不符合，应首先检查培养物的纯度。对已污染的培养物，不应丢弃，因为污染菌可能掩盖沙门菌，故应对被污染的培养物重新分离，仔细选取单个菌落再进行试验,2005,年,4,月,16,日星期六,84,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,7.5,严格按照试验要求操作,所有生化反应均需按照规定的试验要求进行，如观察三糖铁琼脂斜面反应的时间，应在,24,2h,，,时间过短过长，都可能出现错误结果判断。又如氰化钾试验，试管口应密塞，否则氰化钾浓度降低，致使抑菌作用下降,2005,年,4,月,16,日星期六,85,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,7.6,凝集试验的影响因素,血清凝集试验的影响因素甚多，除与电解质、,pH,、,温度有关外，须特别注意抗原与抗体用量的比例恰当，只有当二者浓度适当时，凝集反应方明显可见。由于本法试验用多价血清，其凝集力相对较弱，试验用菌液量切不能过大。测试前，应用已知阳性菌测试以掌握适宜菌液浓度,2005,年,4,月,16,日星期六,86,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,7.7,防止污染,沙门菌为肠道重要致病菌，操作时应特别注意防止分离待检菌及阳性对照菌对操作环境及试验的污染。所有用过的增菌、分离、生化试验培养基、血清学凝集试验及染色镜检后的玻片等，均需经灭菌后方能洗涤,2005,年,4,月,16,日星期六,87,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,三、铜绿假单胞菌检查法 ,2005,年,4,月,16,日星期六,88,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,1,简述,铜绿假单胞菌,，,习称绿脓杆菌，为假单胞菌属菌种,广泛分布在土壤，水及空气，人和动物的皮肤、肠道、呼吸道均有存在，故可通过环境和生产的各个环节污染药品。本菌是常见的化脓性感染菌、在烧伤、烫伤，眼科及其他外科疾患中常引起继发感染，由于本菌对许多抗菌药物具有天然的耐药性，增加了治疗的难度、国内外药典均将铜绿假单胞菌检查列为检查项目之一,2005,年,4,月,16,日星期六,89,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,2,对照用菌液,铜绿假单胞菌,CMCC(B)10104,营养琼脂斜面培养物少许，接种至,5ml,营养肉汤培养基内，于,36,1,培养,18,24h,后，用,0.9%,无菌氯化钠溶液稀释至,1,：,10,6,，使对照菌加入量含,50,100,个,cfu,(,一般用量为,0.1ml),，,菌数在做阳性对照实验的同时用营养琼脂平板涂布经培养后计数确定,2005,年,4,月,16,日星期六,90,中国药品生物制品鉴定所抗生素室,3,操作方法,2005,年,4,月,16,日星期六,91,中国药品生物