基因工程第四章载体.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,在基因工程操作中，把能携带外源,DNA,进入受体细胞的,DNA,分子叫载体。,1.,载体（,Vectors,）,载体的功能,:,1,、运送外源基因高效转入受体细胞；,2,、为外源基因提供复制能力或整合能力；,3,、为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。,（,1,）在宿主细胞内能独立复制。,（,2,）有选择性标记。,（,3,）有一段多克隆位点。,2.,基因工程对载体的要求,外源,DNA,插入其中不影响载体的复制。,（,4,）分子量小，拷贝数多。,（,5,）容易从宿主细胞中分离纯化。,基因工程中常用的载体有,5,类：,3.,载体 的种类,质粒（,plasmid,）,单链,DNA,噬菌体,M13,噬菌体的衍生物,柯斯质粒（,cosmid,）,动物病毒（,virus,）,（,4,）质粒的空间构型：,共价闭合环状,DNA,（,cccDNA,),呈超螺旋（,SC,）（,super coil,）,Covalent close circular DNA,线形,DNA,（,linear,，,lDNA,）,一条链上有一至数个缺口。,开环,DNA,（,open circular,，,ocDNA,）,同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：,scDNA,最快、,l DNA,次之、,ocDNA,最慢。,SC,OC,L,（,5,）质粒空间构型与电泳速率,在大肠杆菌中的质粒，可以分为：,接合型质粒,:,非接合型质粒,能自我转移,不能自我转移,二、质粒的类型,除了带有自我,复制,所必需的遗传信息外还带有一套控制细菌,配对,和质粒,接合转移,的基因。,如：,F,质粒（性质粒、或,F,因子）：,甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。,又叫,自我转移型质粒,。,1.,接合型质粒：,不符合基因工程的安全要求。,虽然带有自我,复制,所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒,接合转移,的基因，因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。,（,1,）,R,质粒（抗性质粒）：,带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状（,resistance,）。,符合基因工程的安全要求。,2.,非接合型质粒：,带有控制,大肠杆菌素,（,colicin,）合成的基因。,（,2,）,Col,质粒：,大肠杆菌素对不带,Col,质粒的大肠杆菌有毒。,Col,质粒或,R,质粒如果带有转移基因，也可以成为接合型质粒。,三、质粒的复制类型,1.,严紧型质粒（,stringent plasmid,）,拷贝数少,，只有,13,份拷贝。,2.,松弛型质粒（,relaxed plasmid,）,拷贝数多,，有,1060,份拷贝。,（接合型质粒分子量大，一般属严紧型）。,（非接合型质粒分子量小，一般属松弛型）。,（,1,）分子量大，拷贝数低,1.,天然质粒的局限性,第一个用于基因克隆的天然质粒,pSC101,，分子长,9.1 kb,。,但只有一个,EcoR I,切点充当克隆位点，,Tet,r,作为筛选标志。,四、质粒载体的构建,ColE1,质粒的筛选标志是大肠杆菌素,E1,（,colicin E1,）。,（,2,）筛选标志不理想,可以通过插入失活筛选。但细菌群体容易自发突变出抗,colicin E1,的细胞,.,colicin E1,能杀死不含,ColE1,质粒的菌，形成“,噬菌斑,”。,唯一的克隆位点,EcoR I,正好位于这个基因的内部。,（,1,）具有复制起点（,ORI,）,2.,质粒载体必须具备的基本条件,（,2,）具有抗菌素抗性基因,（,3,）若干限制性内切酶的单一位点：,是筛选的标志。理想的载体应该有两种抗菌素抗性基因。,用来插入外源,DNA,片断。且插入后不影响复制功能。,多克隆位点,ori,复制起始点,遗传标记,Amp,polylinker,（,4,）具有较小的分子量和较高的拷贝数。,氨苄青霉素抗性（,Amp,r,）,卡那霉素抗性 （,Kan,r,）,四环素抗性 （,Tet,r,）,链霉素抗性 （,Str,r,）,氯霉素抗性 （,Cml,r,）,3.,质粒的选择标记及其工作原理：,（,1,）选择标记,抗菌素抗性,绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记：,常用抗菌素的抗性工作原理,i,）氨苄青霉素（,Amp,icillin,，,Amp,）,青霉素的衍生物。,通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应，杀死生长的细菌。,a,）抑菌原理,b,）细菌抗性原理,Amp,r,基因编码,-,内酰胺酶,，特异地切割氨苄青霉素的,-,内酰胺环。,通过与,50S,核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死,生长的细菌,。,b,）细菌抗性原理,Cml,r,编码,乙酰转移酶,，特异地使氯霉素乙酰化而失活。,a,）抑菌原理,a,）杀菌原理,iii,）卡那霉素（,kan,amycin,，,Kan,）,通过与,70S,核糖体结合，导致,mRNA,发生错读杀死细菌。,b,）细菌抗性原理,Kan,r,编码的,氨基糖苷磷酸转移酶,，对卡那霉素进行修饰，阻断其与核糖体结合作用。,a,）杀菌原理,通过与,30S,核糖体亚基结合，导致,mRNA,错译。杀死细菌。,b,）细菌抗性原理,Str,r,编码一种,氨基糖苷磷酸转移酶,对链霉素进行修饰，阻断其与核糖体,30S,亚基结合作用。,b,）细菌抗性原理,a,）抑菌原理,通过于,30S,核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌。,Tet,r,编码,特异性蛋白质,，对细菌的膜结构进行修饰，组止四环素通过细胞膜进入细菌细胞内。,使受体菌发生遗传性状的改变的基因。,当带有,抗菌素抗性基因,的,载体,进入,受体菌,后，受体菌才能生长。,不带有,抗菌素抗性,基因的受体菌不能在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中生长。,（,2,）抗菌素选择原理,活,死,抗性基因,抗菌素,（,1,）高拷贝数的质粒载体,ColE1,、,pMB1,派生质粒具有高拷贝数的特点。,而且在没有菌体蛋白质合成的条件下（蛋白质合成抑制剂，氯霉素等存在下）仍能复制，达到每个细胞的拷贝数,1000,3000,个！,适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的基因产物。,4.,人工构建的质粒载体的类型,但有特殊用途,:,由,pSC101,派生来的载体特点是分子量小，拷贝数低。,当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重地影响寄主菌的正常代谢活动，导致寄主菌死亡时，就需要低拷贝的载体。,pLG338,、,pLG339,、,pHSG415,等,不适合大量扩增,DNA,用。,（,2,）低拷贝数的质粒载体,这是一类,温度敏感型复制控制,质粒。,温度低（低于,37,o,C,），拷贝数很少；,温度增加（,40,o,C,）时，拷贝数会很快增加到,1000,个以上。,如,pBEU1,、,pBEU2,。,runaway plasmid vectors,1979,年,B.E.Uhlin,等构建。,（,3,）失控的质粒载体,载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。,如,pDF41,、,pDF42,、,pBR329,。,抗菌素抗性,外源,DNA,无抗菌素抗性,（,4,）插入失活型质粒载体,如,pUR2,、,pTR262,等。,只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。,直接选择转化后的细胞。,目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体。,Direct selection vectors,（,5,）正选择的质粒载体,主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。,如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的真核生物的基因置于大肠杆菌的转录,翻译信号控制之下。,注意启动子的性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确。,（,6,）表达型质粒载体,复制起始点,ORI,、,选择标记、,多克隆位点,MCS,2,）大肠杆菌操纵子元件,阻遏基因,I,操纵基因,O,启动基因,P,核糖体结合位点序列（,SD,）,转录终止信号区。,1,）普通载体元件,表达载体的,结构,1.pSC101,第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质粒载体。,（,1,）类型,:,天然质粒，属低拷贝型。,（,2,）长度,:,9.09 kb,。,（,3,）选择标记,:,四环素抗性,Tet,r,五、经典的大肠杆菌质粒载体,7,个克隆位点：,EcoR I,、,Xho I,、,Pvu I,、,Hind III,、,BamH I,、,Sal I,、,Sma I,。主要使用,EcoR I,。,（其中,Hind III,、,BamH I,、,Sal I 3,个位于选择标记,Tet,r,的内部）,（,4,）克隆位点,（,1,）类型,天然质粒，属高拷贝型。,（,2,）长度,6.3 kb,。,（,3,）选择标记,大肠杆菌素（,colicin,）,E1,和对,E1,免疫的基因（,immE1,）,特点是在培养基中加入氯霉素抑制细菌蛋白质合成后，质粒仍然能复制达到每个细胞,1000-3000,拷贝之多！,2.ColE1,colicin E1,基因的结构,cea,imm,kil,结构基因,免疫基因,溶菌基因,杀死不含有,ColE1,细菌的原因,cea+kil,基因产物,不被其他细菌的,colicin E1,所杀死的原因,imm,基因,EcoR I,位于,E1,内部，插入外源,DNA,会导致,E1,失活，使受体菌不能合成,E1,（,ColE1,-,），但仍然表现出对,E1,免疫型（,ImmE1,+,）。,EcoR I,（,4,）克隆位点,Colicin E1,外源,DNA,无,Colicin,EcoR I,用对外源,colicin E1,的免疫性和自身不能合成,colicin E1,作选择，操作非常繁杂。,对,colicin E1,敏感的细菌群体中自发突变产生抗,colicin E1,的频率很高！,（,5,）,ColE1,的选择缺陷,ColE1,抗,colicinE1,杀,ColE1,-,仍抗,colicinE1,不杀,ColE1,-,插入片断,ColE1,pSP2124,质粒的,Amp,r,基因,3.pBR322,：,（,1,）元件来源,F.Bolivar,和,R.L.Rodriguez,人工构建载体。,复制起点,ori,pMB1,系列（来源于,ColE1,）的,高拷贝,型复制起点,Amp,r,基因,Tet,r,基因,pSC101,的,Tet,r,基因。,（,2,）长度,4363bp,（,3,）选择标记,氨苄青霉素和四环素抗性。,（,4,）克隆位点,其中,9,个会导致,Tet,r,基因失活,（如,BamH I,、,Hind,、,Sal I,）；,3,个会导致,Amp,r,基因失活,（,Sca I,、,PvuI,、,Pst I,）。,24,个克隆位点。,双抗菌素抗性选择标记,插入失活，分两次先后选择：,没有获得载体的寄主细胞,在,Amp,或,Tet,中,都,死亡。,获得载体的寄主细胞,在,Amp,或,Tet,其中之一,中死亡。,（,5,）,pBR322,的优点,外源基因,Pst I,Tet,中存活,但在,Amp,中死亡,外源基因,BamH I,Amp,中存活,但在,Tet,中死亡,氯霉素扩增之后，每个细胞可达,1000,3000copy,安全,失去了转移蛋白基因,mob,（,mobilization,）。不能通过接合转移。,高拷贝数,分子小，克隆能力大,载体越小越好。,10kb,的,DNA,在纯化过程中容易断裂。,保留了转移蛋白（,mob,）的,作用位点,。,（,6,）,pBR322,的缺点,能够被,ColK,质粒编码的,mob,蛋白识别，如果再有,F,质粒的参与，就有可能转移！,删除,mob,识别位点,（如质粒,pBR327,、,pAT153,等）。,pAT153,：,从,pBR322,上切去,HaeII,片断，既除去了,mob,识别位点，又增加质粒的拷贝数。,（,7,）,pBR322,的改进,pBR325,：,在,pBR322,位点上接入一段来自噬菌体,PICm,的,HaeII,酶切片断（带有氯霉素抗性基因,cml,r,）。,cml,r,上也带一个,EcoRI,位点。,改造,EcoR I,位点,使,EcoRI,也成为插入失活型位点。,U,niversity of,C,alifornia,的,J.Messing,和,J.Vieria,于,1987,年，在,pBR322,的基础上改造而成。属正选择载体。,pUC7,、,pUC8,、,pUC9,、,pUC10,、,pUC11,、,pUC18,、,pUC19,4.pUC,系列,复制起点,pBR322,的,ori,但其上失去了克隆位点。,Amp,r,基因,（,1,）元件来源,lacZ,的启动子,大肠杆菌,lacZ,基因,大肠杆菌,lacZ,的,-,肽链序列，是,LacZ,的氨基端片断。,pBR322,的,Amp,r,基因,（,2,）长度,约,2.7kb,（,3,）克隆位点,10,个连续的单一限制酶切位点，位于,lacZ,基因的,5,端。,（,4,）选择标记,Ampicillin,抗性,和,lacZ,的,肽互补,（蓝白斑）相结合。,更小的分子量：,如,pUC18,为,2682bp,，,pUC8,为,2750bp,。,选择方便,Xgal,显色、抗菌素双重直接选择。,克隆便利,具有多克隆位点（,MCS,），使有两个不同粘性末端的外源,DNA,方便地插入。,测序方便,Amp,r,PSP6,MCS,PT7,lacZ,pGEM-3Z,2743 bp,ori,1.pGEM-3Z,由,pUC,派生而来。,与,pUC,的主要区别是在,MCS,的两侧分别加了一个噬菌体,启动子,T7,和,SP6,。,可被,T7,和,SP6,的,RNA,聚合酶识别转录。,如果加入纯化的,T7,或,SP6 RNA,聚合酶，在试管里就可以转录,mRNA,外源基因正接反接都可以转录。,MCS,与,pUC18,的完全一样。,2.pGEM-4Z,：,与,pGEM-3Z,相同，只是,T7,启动子和,SP6,启动子的,位置互换,。,（,1,）,pGEM-3Z,的特点：,（,1,）穿梭质粒载体的结构,人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。,（,shuttle plasmid vectors,）,3.,穿梭质粒载体,Yeast,复制起点,E.coli,复制起点,E.coli,选择标记,Yeast,选择标记,MCS,大肠杆菌,枯草杆菌穿梭载体,大肠杆菌,酿酒酵母穿梭载体,大肠杆菌,动物细胞穿梭载体,（,2,）常用的穿梭质粒载体,也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达。,可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。,克隆、构建,表达,E.coli,Animal cell,利用大肠杆菌进行基因克隆、表达,（,3,）穿梭载体的优点,1.,质粒稳定遗传必须的两个条件：,（,1,）每个世代、每个质粒至少要复制一次,（,2,）在细胞分裂时，复制过的质粒必须分,配到两个子细胞中。,七、质粒载体的不稳定性,有主动分配和随机分配两种假说。,（,1,）主动分配,天然质粒。,2.,质粒分配方式,具有一个控制质粒拷贝分配的功能区（,Par,），能以主动分配的方式确保质粒能正确分配到两个子细胞中。,人工构建的质粒载体,缺失了,par,区,，只能以随机分配方式分到子细胞中。,人工质粒。,（一般情况下也能保证质粒的稳定遗传）,（,2,）随机分配,但在一定条件下会出现质粒丢失的现象。,在寄主菌细胞分裂的过程中，有一个细胞没有获得质粒拷贝，并最终繁殖成无质粒的优势群体。,3.,分离的不稳定性,（,segregation instability,）,（,structural instability,）,寄主基因组的,IS,序列插入质粒、质粒间的同源重组等都会使质粒发生插入或缺失。,IS,dimer,重组,4.,结构的不稳定性,（,1,）新陈代谢负荷：,5.,影响质粒载体稳定性的主要因素,使寄主细胞生长减缓：,质粒载体使寄主的世代时间延长约,15%,。,复制负荷,减缓的程度与质粒的分子量成正比。,转录和翻译负荷,丢失质粒的细胞反而会成为优势群体！,每个菌体中所拥有的质粒拷贝数不完全相同，称差度。,（,2,）质粒载体的拷贝数,低拷贝数的质粒的差度小，遗传稳定。,差度（,variance,）：,是产生无质粒细胞的重要原因。,高拷贝数的质粒载体差度大，拥有少量拷贝数的菌体多，发生丢失的可能性大。,野生型,E.coli,中，质粒在寄主的,重组酶,作用下会发生重组形成,二聚体质粒,。,（,3,）寄主菌的重组体系,二聚体灾难（,dimer catastrophe,）：,含有大分子量插入片断的质粒载体普遍能形成质粒寡聚体。,二聚体质粒的复制速度是单体的二倍！导致质粒失控。,噬菌体是一类细菌病毒（,Bacteriophage,）。,一、噬菌体的一般特性,结构,：,蛋白质外壳内包裹着,DNA,（双链、单链、线性、环状等）。,single linear DNA(about 182,000 bp),T2 Genomic DNA,分为两种：,1.,溶菌周期：,感染细菌后立即在菌体内复制和合成蛋白质外壳，重新组装成噬菌体颗粒，并导致细菌细胞解体，释放出大量子代噬菌体。,烈性噬菌体（,virulent phage),二、噬菌体的生活周期,感染细菌后，将自己的,DNA,整合到细菌的染色体,DNA,中。形成这一过程称为溶源化（,lysogenization),。,整合到细菌染色体的噬菌体,DNA,称为,原噬菌体,，随细菌的染色体复制而复制。,温和噬菌体（,temperate phage),原噬菌体（,prophage),：,2.,溶源周期：,M13,、,f1,、,fd,噬菌体,单链环状,DNA,的丝状大肠杆菌噬菌体：,三、单链噬菌体载体,（,2,）复制型（,RF,）是双链环状,DNA,。,1.,单链,DNA,噬菌体的特点,（,3,）,RF DNA,和,ssDNA,都能转染感受态,大肠杆菌。并产生噬菌斑。,（,5,）可产生大量的含有外源,DNA,插入片,断的,单链分子,，便于作探针或测序。,（,1,）,+DNA,。（,ssDNA,）,（,4,）不存在包装限制。,RF dsDNA,在寄主细胞内以高拷贝形式存在。,成熟的噬菌体里只包装有,+DNA,，也容易提取。,M13,噬菌体只感染,雄性,大肠杆菌。,但,M13 DNA,可以转染雌性大肠杆菌。,6407 bp,。,（,2,）,DNA,长度,（,3,）,DNA,提纯,（,1,）寄主,2.M13,噬菌体,虽然不导致溶菌，但使菌斑混浊（细菌生长变慢，约为正常的,1/2,3/4,）,M13,通过雄性细菌的,F,性须,注入其,+DNA,+DNA,合成,DNA,，形成,RF dsDNA,DNA,转录,mRNA,、合成,+DNA,、翻译形成噬菌体蛋白,组装成新的噬菌体,M13,，,挤出寄主细胞,（,4,）,M13,的生活周期,+DNA,-DNA,mRNA,M13,外壳蛋白,组装成子代,M13,+DNA,注入大肠杆菌,复制,转录,翻译,+DNA,指导合成,+DNA,200,个,RF DNA,每个细胞可以放出约,1000,个,M13,颗粒！,M13,的包装过程：,RF dsDNA,指导合成的,+DNA,M13,基因,V,编码单链,DNA,结合蛋白,DNA-,蛋白质复合物,转移到寄主的细胞膜,M13,外壳蛋白,基因,V,蛋白脱落,+DNA,溢出细胞膜,包装,（,5,）没有包装限制,M13,基因组中只有基因,II,与基因,IV,之间存在一段,507bp,的基因间隔区。,（,1,）克隆区域的选定,基因间隔区（,intergenic region,IG,区）,IG,区内只有一个,BsuI,切点。,其余,9,个,BsuI,限制性位点分布在其它部位。,酶切位点,3.M13,载体的构建：,在,IG,区内插入一个大肠杆菌的,LacZ,（,-,肽序列,),。,利用,-,肽序列中的三个单一酶切位点（,Bgl II,、,Ava II,和,Pvu I,）。,（,2,）加入酶切位点,在,IG,区内加入单一内切酶位点,第一个,M13,载体：,M13mp1,：,M13 RF,BsuI,不完全消化,各种长度的线性片断,（其中应有只在,IG,上切开的线性全长,M13,）,E.coli,lac,基因的,HindII,片断,(,lacI,、,lacP,、,lacO,、,lacZ,）,连接,M13mp1,JM101,宿主,只有在,IG,区插入,lacZ,才能存活并在,Xgal,上出现互补的蓝噬菌斑,Ampicillin,抗性,和,lacZ,的,肽互补,（蓝白斑）相结合。,选择标记,蓝白斑选择原理：,Xgal,（,5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-,-D-galactoside,）,5-,溴,-4-,氯,-3-,吲哚基,-b-D-,半乳糖苷,-,半乳糖苷酶,能把无色的化合物,Xgal,分解成半乳糖和一个,深蓝色,的物质,5-,溴,-4-,氯靛蓝。,Xgal,半乳糖,5-,溴,-4-,氯靛蓝,-,半乳糖苷酶,-,半乳糖苷酶,Xgal,显色反应：,蓝色化合物,1,）,-,肽（,lacZ,）：,-,半乳糖苷酶,N,端的一段氨基酸片断（,11-41,氨基酸）。,lacZ,只有在,4,聚体的状态下才有功能,.,C,端大部分,N,端的,11-41aa,C,端大部分,N,端的,11-41aa,C,端大部分,N,端的,11-41aa,C,端大部分,N,端的,11-41aa,4,聚体,lacZ,的,肽互补,2,）受体菌,lacZ,突变（,lacZ,M15,）,受体菌基因组的,-,半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失,肽），不能形成,4,聚体的活性酶，不能分解,Xgal,受体菌株：,JM,系列,、,TG1,、,TG2,、,XL1-blue,、,XS127,、,XS101,、,KK2186,、,MV1184,、,DH5a,pUC,质粒,(M13),载体上的,lacZ,编码,肽与这个缺失突变的,-,半乳糖苷酶,“互补”，,使它能形成,4,聚体。又能分解,Xgal,。产生蓝色物质。,C,端大部分,N,端的,11-41aa,pUC,(M13),lacZ,受体菌,lacZ,3,）载体,lacZ,与,互补,pUC,(M13),载体上,LacZ,的,5,端有一段多克隆位点,(MCS),区，本身虽不干扰,LacZ,的合成，但插入外源基因就会阻止,LacZ,的合成。不能互补。,lacZ,5,3,肽移码突变,lacZ,5,3,肽,不互补,互补,MCS,外源,DNA,IPTG,是乳糖的类似物。能诱导,lac,操纵子的启动转录，使受体菌基因组中的,lacZ,的,C,端部分,和载体的,lacZ,肽,都表达。从而互补。,但载体,MCS,上插入外源,DNA,后，仍然不能产生,肽！,IPTG,的诱导作用,通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有,DNA,插入。,MCS,无插入时，互补，蓝菌斑。,MCS,有插入时，不互补，白菌斑。,IPTG,诱导的结果：,加上常用的酶切位点。,M13,载体系列的命名,M13mp,n n,代表系列数字,对,M13mp1,的改进,B.Gronenborn,和,J.Messing1978,年把,LacZ,5,端的第,13,个核苷酸,G,突变成,A,，产生了一个,EcoR I,切点。,M13mp2,：,（,3,）,M13,载体系列,5ATGACCATGATTAC,G,G,ATTC,A-,Me,用,N-,甲基,-N-,亚硝基脲 把,G,甲基化,5ATGACCATGATTAC,G,G,ATTC,A-,转染,E.coli,。,m,G,与,T,配对，复制两次后,5ATGACCATGATTAC,G,A,ATTC,A-,EcoRI,切点,用,EcoRI,切,M13mp1,M13mp2,选择能切开的 线性分子,再环化,M13mp1,在,M13mp2,的,LacZ,的,5,端加上一段人工合成的多克隆位点（,MCS,）。,M13mp7,、,M13mp8,、,M13mp9,、,M13mp10,、,M13mp11,、,M13mp18,、,M13mp19,对应有相同,MCS,的,pUC,系列载体：,pUC7,、,pUC8,、,pUC9,、,pUC10,、,pUC11,、,pUC18,、,pUC19,成为,M13mp,系列载体：,对,M13mp2,的进一步改进,（,1,）有,MCS,，便于克隆不同的酶切片段,（,2,）,Xgal,显色反应，可供直接选择,（,3,）无包装限制，克隆能力大,（,4,）可以克隆双链,DNA,分子中的每一条链,子代,M13,噬菌体中包含的是单链,+DNA,。,4.M13,系列载体的优点,MCS,+,-,+,-,+,-,编码链,非编码链,外源,DNA,不同的酶切,不同的酶切,插入,M13 vector,M13 RF,+,-,+,-,+,-,外源,DNA,转染,E.coli,成熟的子代,M13,中,+,+,插入外源,DNA,后，遗传稳定性显著下降,实际克隆能力小于,1500bp,。,虽无包装限制，并非无限包装！,5.M13,载体的缺点,由,质粒载体,与,单链噬菌体载体,的复制起点结合而成的新型载体系列。,MCS,噬菌体,ori,质粒,ori,Amp,r,lacZ,lacI,6.,噬菌粒载体（,phagemid vectors,）,约,3000bp,（比,M13,小）,克隆能力大,能插入,10kb,的外源,DNA,。,两种复制形式,分子量小,（,1,）噬菌粒载体的特点,既具有质粒的复制起点，又具有噬菌体的复制起点。,既能在大肠杆菌中以质粒的形式双链复制，又能在噬菌体内进行单链复制。,噬菌粒载体,质粒部分,单链噬菌体部分,辅助噬菌体,大肠杆菌寄主,pEMBL8,pUC8,f1,IR1,71/18,pRSA101,VX,M13,M13,变异株,XS127,，,XS101,pUC118/pUC119,pUC18/,pUC19,M13,M13K07,MV1184,pBS,pUC,f1,M13K07,XL1-Blue,辅助噬菌体用来复制和包装噬菌粒载体。,（,2,）常见的噬菌粒载体,构成,1,）,M13,的基因间隔区（,IG,）,2,）,pUC18/pUC19,质粒载体：,带有,M13,复制起点。,质粒复制起点,Amp,r,lacZ,MCS,（,3,）,pUC118/pUC119,两种不同的复制模式,1,）双链质粒复制模式,受,pUC,本身的复制起点（来源于,ColE1,）的控制。,每个细胞能达到,500,个拷贝。,pUC118/119,的复制模式,来源于,M13,的复制起点被,辅助噬菌体,的基因,II,产物控制。,2,）单链滚环噬菌体复制模式,外壳蛋白,复制蛋白,辅助,M13,包装,当寄主细胞被,辅助噬菌体,M13,感染后。,1,）辅助噬菌体：,自身的,复制起点发生了突变,，复制效率低下，但感染细菌后能表达出,外壳蛋白和复制蛋白,，帮助噬菌粒载体复制。,如,M13K07,等。,辅助噬菌体,外壳蛋白和,复制蛋白,噬菌粒载体,ssDNA,噬菌体,噬菌粒载体的包装,2,）包装：,Stratagene,公司发展的一类噬菌粒载体。,由,pUC,质粒载体、,f1,噬菌体的复制起点和,T3,、,T7,噬菌体的启动子,组成。,特点,组成,MCS,两侧分别加上,T3,和,T7,噬菌体的启动子。加入适当的噬菌体,RNA,聚合酶，就可以定向体外转录。,1,）定向体外转录,（,4,）,pBluescript,噬菌粒载体（,pBS,）,2,）两种复制模式,既能以质粒的形式复制，又能以噬菌体的形式复制包装。,3,）选择方便,有,Amp,r,和,lacZ,，可以进行,Amp,抗性选择和,Xgal-IPTG,蓝白斑选择。,4,）插入方便,18,个单一酶切位点的,MCS,SK,：表示,lacZ,的,转录方向,是沿,MCS,上的,S,acI,K,pnI,+,（,f1+,）：单链,复制起始方向,背离,lacZ,，能回收,lacZ,的编码链（,+,）,pBluescript SK,（,+/-,）,/pBluescript KS,（,+/-,）,KS,：反向（,K,pnI,S,acI,，,MCS,相反）,-,（,f1-,）：能回收,lacZ,的非编码链（,-,）,1,）,pBluescript SK/KS,（,+/-,）区分：,常用的,pBluescript,载体,pCR,系列载体,Invitrogen,公司开发的,线性,噬菌粒载体。,结构,pUC,的质粒部分、,fi,噬菌体,ori,、,Kan,r,和,Amp,r,抗性。,MCS,的中部已经切开，各有一个,3,端突出的,T,。,特点,PCR,产物往往在,3,端突出一个,A,，所以能与这个载体直接连接。,（,5,）,PCR,产物克隆载体,T,载体,A,A,T,T,T vector,PCR product,T4 DNA ligase,A,A,（,1,）噬菌体展示（,Phage display,）,将外源蛋白（多肽、酶、抗体、,DNA,结合蛋白）结合到噬菌体的外壳蛋白上形成融合蛋白，表达于,噬菌体的外表面,。,G.P.Smith1985,年发明。,丝状噬菌体（,M13,、,f1,等）外壳颗粒的一端，有,3-5,个基因,编码的蛋白质（,g3p,），在识别和吸附大肠杆菌的过程中起作用。,7.,噬菌体展示载体（,Phage display vector,）,把外源,DNA,片断插入基因,的序列,前端,，并保持两者的阅读框正确，表达出融合蛋白。,启动子,外源,DNA,M13,基因,ori,M13 display vector,外源多肽,（,2,）噬菌体展示载体的构建,（,1,）长度为,48502 bp,；,（,2,）双链线性,DNA,；,（,3,）但在两端有,cos,位点，可以环化。,DNA,两端各有,12bp,的粘性末端，粘性末端形成的双链区域称为,cos,位点。,1.,DNA,分子的特点,cos,位点（,cohensive-end site,）：,四、双链噬菌体载体,载体,5 TCCAGCGGCGGGG,CCCGCCGCTGGA 5,COS,3,3,DNA,上有至少,61,个基因，有一半是必须的，与自身的活动有关，成簇排列。,其他约,1/3,是,非必须基因（,位于尾部合成至阻遏之间的区段）。,2.,噬菌体的基因组特点,噬菌体感染细菌的早期：双链进行,型复制。,3.,DNA,的复制 模型,（,1,）,型复制,（,2,）滚环复制,感染的晚期：启动滚环复制机制。,形成多联体,DAN,分子。,这种多联体分子必须在,cos,位点被切断成单体分子才能被包装起来。,（,1,）构建原理：,4.,噬菌体载体的构建,（,2,）构建过程,在这个非必须区内制造限制酶切点,引进某些突变表型，作为选择标记,突变某些基因，使它成为安全载体,删除,DNA,必须区段上常用的限制酶切点,噬菌体,DNA,上本身有,5,个,EcoR I,和,7,个,Hind III,切点！,删除,噬菌体的非必需区，留出插入空间。,插入型载体（,insertion vectors),：,如,gt10,、,gt11,、,BV2,、,NM540,、,NM1590,、,NM607,1,）免疫功能失活型：,插入位点位于载体合成活性,阻遏物区域,（,cI,基因）内。,EcoR I,cI,gt10,（,3,）人工构建的,噬菌体载体有两种类型：,插入导致载体不能合成阻遏物，,载体,DNA,不能进入溶源期，受体菌全部裂解，形成,清晰的噬菌斑。,没有外源,DNA,插入的,载体感染受体菌形成,混浊噬菌斑。,如,NM1149,载体的两个克隆位点（,EcoR I,和,Hind III,）都是位于,cI,基因内部。,在,基因组中引入了,LacZ,序列。（其上含有一个,EcoR I,克隆位点）。,感染,LacZ,突变的大肠杆菌，经,IPTG,的诱导，利用,Xgal,的显色反应,作选择标记。,LacZ,EcoR I,Charon16A,选择标记,:,两个多克隆位点区以反向重复形式分别位于,DNA,的非必须区两端。,用酶切后，可以将中间的区段切下来，与用同样酶切成的外源,DNA,片断置换。,可置换区,MCS,MCS,如：,EMBL4,、,Charon40,等。,替换型载体（,substitution vectors),EMBL4,的可置换片断内部还有,Sal I,酶切位点。,以便于进一步消化中间片断，防止自我连接。,左臂,可置换区,右臂,EcoR I,BamH I,Sal I,Sal I,BamH I,EcoR I,Sal I,Sal I,EMBL4,Charon40,的可置换片断是由,DNA,短片重复构成，片断之间有,Hae I,切点,。,在克隆的时候，可以用,Hae I,酶进一步将可置换片断切成小片断，以防止重新与载体连接。,左臂,可置换区,右臂,MCS,MCS,Charon40,Hae I,可取代片断中如果包含,LacZ,，可用,Xgal,显色,作筛选标记。,（,4,）,载体的筛选标记,c,I,基因功能选择,cI,基因缺失或失活,培养基上形成,清晰的噬菌斑,.,LacZ,基因功能选择,DNA,象质粒载体那样直接转化细菌时效率远比质粒低。,5.,载体的体外包装,在试管中与,噬菌体的,头部,和,尾部,蛋白人工装配成噬菌体颗粒，才能高效地感染细菌，把重组,DNA,注入受体菌中。,必须利用噬菌体外壳的作用！,（,1,）体外包装：,的,D,基因的产物也是头部蛋白，但主要与,DNA,进入头部和头部的成熟有关（只占,20%,）。,（,2,）体外包装过程,噬菌体外壳蛋白的合成,E,基因,的,E,基因编码头部蛋白的主要成分（占头部总蛋白的,70%,）。,D,基因,E,基因突变,只合成尾部蛋白和包装识别蛋白,D,基因突变,合成头部蛋白和尾部蛋白，但不能聚合和包装,DNA,提取尾部蛋白,提取头部和尾部蛋白,重组的,载体,DNA,体外包装成活性噬菌体,外源的重组,DNA,载体被诱发与内源性原,DNA,发生重组。,（,3,）体外包装存在的问题：,包装错误：,既能包装用于生产头部蛋白的,内源性原,DNA,，也能包装,重组的,DNA,载体,。,重组：,体外包装的容量限制：,必须在正常野生型容量的,75%105%,（,3651kb,）,之间。,既不能超过正常野生型容量的,5%,；,又不能低于正常野生型容量的,75%,野生型,DNA,的必须区是,28kb,，所以,载体的最大克隆容量是,23kb,。（,实际上为,15kb,）。,比一般的质粒载体的容量大的多。,用在真核生物基因组文库的建立。,（,4,）,DNA,载体的优点,可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌,1978,年,J.Collins,和,B.Hohn,等人发展出,cosmid vector,（,cos,site-carrying plas,mid,),DNA,：,46kb,（,1,）大小,（,2,）组成,6.cosmid,载体（粘粒）,cos,序列和控制包装的的序列。,pBR322,：,质粒的复制子,抗药性基因,几个限制性酶的单一位点,具有,噬菌体的特性：,（,3,）,cosmid vector,的特点,克隆外源,DNA,后可以,体外包装,成噬菌体颗粒。,在寄主细胞内形成环化,DNA,（但不能形成新的噬菌体颗粒而溶菌）。,具有质粒载体的特性：,大多带有,pMB1,或,ColE1,的复制子，能象质粒一样复制。,有抗菌素抗性基因，和插入失活的克隆位点。,方便的选择：,高容量的克隆能力：,45kb,（最少不能低于,30kb,）。,51kb-5kb=45kb,应用,cosmid,载体在大肠杆菌中克隆大片端的真核基因组,DNA,技术，叫“柯斯克隆”（,cosmid cloning,）。,（,4,）,cosmid cloning,理论依据：,cos,位点,:,噬菌体的生命周期中，会产生