微生物活菌计数方法专家讲座.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,微生物计数方法种类,直接计数法,核酸计数法,活菌计数法（培养法）,MPN（Most-Probable-Number）最大可能数法,混菌法,平板技术法,微生物活菌计数方法专家讲座,第1页,直接计数法,1.显微镜直接计数,比浊法,3.电子计数器计数法,微生物活菌计数方法专家讲座,第2页,1.显微镜直接计数,显微计数法适合用于各种含单细胞菌体纯培养悬浮液,血球计数板：菌体较大酵母菌或霉菌孢子,细菌计数板：普通细菌,用途：快速了解发酵液菌数。惯用于生产线上生产过程控制。,缺点：不易区分颗粒、死菌体和杂菌，计数与真实菌数有很大差异。不能作为正规计数方法。,微生物活菌计数方法专家讲座,第3页,2.比浊法,依据菌悬液透光量间接地测定细菌数量。细菌悬浮液浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，所以，可用光电比色计测定菌液，用光密度(OD值)表示样品菌液浓度。依据浊度计算出细菌数量。该方法普通能够预计出细菌数量级。经惯用于一些特殊微生物快速计数，如光合细菌和藻类测数。不过因为该方法仅能估测菌数，不能准确定量，而且因为一些颗粒和添加剂作用，不能正确反应该样品质量，所以在质检过程中不予采取。,微生物活菌计数方法专家讲座,第4页,3.电子计数器计数法,工作原理是测定小孔中液体电阻改变，小孔仅能经过一个细胞，当一个细胞经过这个小孔时，电阻显著增加，形成一个脉冲，自动统计在电子统计装置上。该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是否为细菌。所以，要求菌悬液中不含任何碎片。不适于微生物肥料产品检测。,微生物活菌计数方法专家讲座,第5页,核酸计数法,每一个生物都有一套自己独有遗传物质，脱氧核糖核酸和核糖核酸，即DNA和RNA。伴随核酸分析技术发展，已经能够利用遗传物质对生物进行定性和定量测定，而且更为灵敏、快速、专一性强。,惯用方法：荧光定量PCR,此法操作精细繁琐，药品昂贵，而且经常受到死菌体干扰。暂时不能成为微生物肥料活菌计数惯用方法，,微生物活菌计数方法专家讲座,第6页,活菌计数法（培养法）,MPN（Most-Probable-Number）最大可能数法（主要用于光合细菌和（粪）大肠菌群测定）,混菌法（适合用于兼性厌氧微生物测定）,取1.0mL不一样稀释度菌悬液于,灭菌,平皿内，将冷却至50左右1520mL培养基倒入培养皿内轻轻混匀，培养计数。（食品中乳酸菌总菌数测定）,平板计数法（最惯用方法）,微生物活菌计数方法专家讲座,第7页,平板计数法,使不可见微生物在人工培养基平板上生长成为可见菌落（CFU），从而可用肉眼进行观察、计数。较其它方法直观准确，是一个经典检测活菌数方法，也是当前国际上通用方法。,制备一定体积菌悬液，作一系列倍数稀释，然后将定量稀释液进行平板培养，依据培养出菌落数，计算出样品中活菌数。,微生物活菌计数方法专家讲座,第8页,平板计数法示意图,微生物活菌计数方法专家讲座,第9页,微生物活菌计数方法专家讲座,第10页,平板计数优缺点,优点：直观、准确、可靠,该方法不但能够检测到样品中有效活菌数，而且能够检测到产品微生物污染情况，即杂菌数。,缺点：,因为培养基和培养条件不足，所得结果普通低于实际值。,微生物活菌计数方法专家讲座,第11页,平板计数法,（一）检测前准备,（二）操作过程（母液制备、系列稀释、加样、涂布、培养、菌落识别、计数）,（三）计算,微生物活菌计数方法专家讲座,第12页,（一）检测前准备,依据菌种特征选择方法,天平，摇床，酒精灯，培养箱，染色液，显微镜，灭菌锅，烘箱等,无菌间或洁净工作台消毒,吸管、刮刀、培养皿洗涤、包扎、灭菌,制样和稀释用三角瓶水制备、灭菌,培养基制备和平板制备,微生物活菌计数方法专家讲座,第13页,培养基制备,培养基定义指人工方法配合而成，专供微生物培养、分离、判别、研究和保留用混合营养物制品。,培养基选择 需要了解目标微生物基本特征，选择正确培养基,培养基制备程序,按微生物肥料试验用培养基技术条件要求执行，NY/T1114-,培养基标识清楚，培养基名称，配制日期等。,检测前准备,微生物活菌计数方法专家讲座,第14页,平板制备,灭好菌培养基冷却至50 左右（以不烫手为宜），在无菌状态下倾注培养基。,倾倒平板前应将培养基摇匀，预防在瓶底有沉淀。不过摇动时要预防产生大量气泡。,通常条件下平板制备好后室温放置或温箱放置23天使用，目标：一能够检验培养基是否灭菌彻底，是否在倾倒过程被微生物污染；二为了使平板表面干湿适宜，预防菌落因为平板上水滴运动而连片以致无法计数。,检测前准备,微生物活菌计数方法专家讲座,第15页,（二）操作过程,2.1 母液制备,2.2 系列稀释、加样和涂布,2.3 培养,2.4 识别和计数,微生物活菌计数方法专家讲座,第16页,2.1 母液（基础液）制备,样品混合均匀：,很主要,固体样品：称取10g左右样品加入到100mL无菌水（500mL三角瓶）中，静置20,min。,液体样品：量取10.0ml样品加入到90mL无菌水（500mL三角瓶）中，静置20min。,分散菌体：将三角瓶置于摇床上200r/min振荡30min，即成母液菌悬液。,微生物活菌计数方法专家讲座,第17页,2.2 样品稀释、加样和涂布,准备工作：,应将平板上做好标识，包含培养基种类，样品编号，稀释度,/,稀释倍数,.,将小瓶无菌水写好样品编号、稀释度/稀释倍数,详细过程见GB20287-农用微生物菌剂,微生物活菌计数方法专家讲座,第18页,2.2.1 系列稀释,用无菌吸管分别吸收 5.0mL 上述母液菌悬液加至45 mL无菌水（150mL三角瓶）中，按1:10(10倍)进行依次稀释，分别得到10,-1,，10,-2,，10,-3,，10,-4,等浓度菌悬液（每个稀释度应更换无菌吸管）,注：稀释度：10,-1,，10,-2,，10,-3,，10,-4,，10,-5,相当于,稀释倍数：10,1,，10,2,，10,3,，10,4,，10,5,微生物活菌计数方法专家讲座,第19页,2.2.2 加样和涂布,每个样品取3个连续适宜稀释度，用0.5mL无菌吸管分别吸收不一样稀释度菌悬液0.1mL，加至预先制好固体培养基平板上，分别用无菌玻璃刮刀将不一样稀释度菌悬液均匀地涂于平板表面。,每一稀释度每种培养基做3个重复，同时以无菌水作空白对照。,微生物活菌计数方法专家讲座,第20页,微生物活菌计数方法专家讲座,第21页,稀释、加样和涂布注意事项,整个程序应在无菌间或超净台内进行，操作人员时刻有,无菌概念,适宜稀释度：依据标准或企业提供信息选择稀释度。,系列稀释时不一样稀释度应更换吸管（移液管），加样和涂布不一样稀释度时也要更换吸管和刮刀。,每个培养皿均要标明培养基种类、样品编号、稀释度,稀释和加样要准确，涂布均匀及时，使用吸管量程要适宜。,无菌水对照，以检验吸管、刮刀以及稀释用水灭菌是否彻底、操作过程是否合乎无菌要求。,微生物活菌计数方法专家讲座,第22页,2.3 平板培养,将涂布好平板放在适宜条件下培养,如：,温度条件,气体条件,培养时间,平板倒置培养,微生物活菌计数方法专家讲座,第23页,2.4 菌落识别和计数,经过菌落识别、涂片染色、镜检观察，确定有效菌。,（必要时做生化试验）,选择性培养基上长出菌落并非都是有效菌，培养基选择性是相正确。,一个有效菌只在一个特定培养基上计数，不一样培养基上同一个有效菌不能累加。,细菌杂菌（包含放线菌）在培养细菌培养基上计数；霉菌和真菌杂菌在真菌培养基上计数。但也不能重复计数。,微生物活菌计数方法专家讲座,第24页,（三）计算,3.1 有效稀释度选择,3.2 标准差,3.3 计算公式及示例,微生物活菌计数方法专家讲座,第25页,3.1 有效稀释度选择,参见标准 GB20287-6.3.2.4,示例：（表格）,微生物活菌计数方法专家讲座,第26页,计数标准,以出现20300个细菌菌落数稀释度平板为计数标准，丝状真菌为10150个菌落数。,当只有一个稀释度，其平均菌落数在20300之间时，则以平均菌落数计算。,若有两个稀释度，其平均菌落数均在20300之间时，应按二者菌落总数之比值决定：,若其比值小于等于2应计算二者平均数；,若大于2则以稀释倍数小菌落平均数计算。,微生物活菌计数方法专家讲座,第27页,例次,不一样稀释倍数,菌落平均数,两个稀释倍数度菌落数之比,菌数,亿/g,mL,10,3,10,4,10,5,1,无法数,无法数,253,/,25.3,2,无法数,315,32,/,3.2,3,313,38,3,/,0.38,4,289,32,2,1.1,0.30,5,无法数,136,34,2.5,/,6,32,5,0,/,0.032,7,15,3,0,/,0.015,微生物活菌计数方法专家讲座,第28页,3.2 标准差,标准差(Standard Deviation)：各数据偏离平均数距离（离均差）平均数，它是离差平方和平均后方根。用,表示。标准差表达随机变量取值与其期望值偏差。,标准 NY411-固氮菌肥料7.2.6.2。,微生物活菌计数方法专家讲座,第29页,平板上菌落数对应标准差要求,平板上菌落平均数，个/皿,20-50,51-99,100-300,标准差,10.0,20.0,50.0,微生物活菌计数方法专家讲座,第30页,标准差分析（例子）,重复I,重复II,重复III,平均数,标准差,35,48,219,100.7,102.7,微生物活菌计数方法专家讲座,第31页,3.3,有效活菌数和杂菌计算,微生物活菌计数方法专家讲座,第32页,示例,样品编号：A,样品状态：颗粒,执行标准：GB20287-,菌种名称：巨大芽孢杆菌,称样量：10.10g,微生物活菌计数方法专家讲座,第33页,重复,稀释倍数,（巨大芽孢杆菌在营养肉汤培养基上）,/,10,3,10,4,10,5,1,无法数,115,15,有效菌数,亿/g,2,无法数,126,19,3,无法数,124,17,菌落,平均数,/,121.7,17.0,1.20,标准差,/,5.9,/,/,微生物活菌计数方法专家讲座,第34页,重复,稀释倍数,（,细菌,杂菌在营养肉汤培养基上）,/,10,3,10,4,10,5,1,无法数,15,2,杂菌数,亿/g,2,无法数,25,4,3,无法数,18,3,菌落,平均数,/,19.3,/,0.19,微生物活菌计数方法专家讲座,第35页,重复,稀释倍数,（霉菌在马丁培养基上）,/,10,3,10,4,10,5,1,6,/,/,霉菌数,个/g,2,7,/,/,3,8,/,/,菌落,平均数,7.0,/,/,0.69,10,6,微生物活菌计数方法专家讲座,第36页,重复,稀释倍数,（真菌杂菌在马丁培养基上，不包含霉菌）,/,10,3,10,4,10,5,1,3,/,/,真菌杂菌,亿/g,2,2,/,/,3,4,/,/,菌落,平均数,3.0,/,/,0.0030,微生物活菌计数方法专家讲座,第37页,微生物活菌计数方法专家讲座,第38页,样品编号,检测日期,年 月 日,室温，,相对湿度，%,仪器名称、编号,1.培养箱 2.洁净室,菌种名称,依据标准,培养温度，,培 养 基,培养时间，h,基础液体积,v,1,，mL,样品量,m,0,(,v,0,)，g(mL),加 样 量,v,2,，mL,稀释倍数,k,菌 落 数(cfu/皿),重复,重复,重复,平均,标准差,n-1,无菌水对照,计算公式：,nm,=10-8,kv,1/(,m,0,v,2)其中,nm,为质量有效活菌数,或,nv,=10-8,kv,1/(,v,0,v,2)其中,nv,为体积有效活菌数,计算结果：亿/g(mL),备 注：,检测人,校核人,审核人,有效活菌数测定原始统计表,微生物活菌计数方法专家讲座,第39页,样品编号,检测日期,年 月 日,室温，,相对湿度，%,仪器名称、编号,1.培养箱 2.洁净室,依据标准,基础液体积,v,1,，mL,样 品 量,m,0,(,v,0,)，g(mL),加样量,v,2,，mL,培养基,1.,培养温度，,1.,培养时间，h,1.,2.,2.,2.,真菌杂菌,细菌杂菌,类别,稀释,倍数,k,1,，,k,2,菌 落 数（cfu/皿）,稀释,倍数,k,3,菌 落 数（cfu/皿）,重复I,重复II,重复III,平均,重复I,重复II,重复III,平均,霉菌,其它,真菌,无菌水对照,无菌水,对照,真菌,杂菌数,霉菌杂菌数,n,1,/g(mL),细菌杂菌数,n,3,亿/g(mL),其它真菌数n2,/g(mL),k,3,v,1,/(v,0,v,2,),有效活菌数,n,m,(,n,v,),亿/g(mL),杂菌率 R,%,计算公式：,R,=100(10,-8,n,1,+10,-8,n,2,+,n,3,)/(10,-8,n,1,+10,-8,n,2,+,n,3,+,n,m,),或,R,=100(10,-8,n,1,+10,-8,n,2,+,n,3,)/(10,-8,n,1,+10,-8,n,2,+,n,3,+,n,v,),备 注：,检测人,校核人,审核人,杂菌测定原始统计表,微生物活菌计数方法专家讲座,第40页,结果判定（示例）,标准要求 产品测定结果,有效菌数：,2.0 亿/g 1.20 亿/g,霉菌数：3.0,10,6,个/g 0.69,10,6,个/g,杂菌率：30.0%14.28%,结论：该样品,有效菌数不合格；,霉菌数和杂菌率合格。,微生物活菌计数方法专家讲座,第41页,回顾关键点,培养前准备,样品制备、稀释、涂布、培养,有效菌和杂菌确实认,计算,微生物活菌计数方法专家讲座,第42页,谢谢,微生物活菌计数方法专家讲座,第43页,