微生物的实验室培养专业知识专家讲座.pptx

课堂讲义,重点,难点 个个击破,一、培养基制备,1.,制备牛肉膏蛋白胨固体培养基,计算：依据牛肉膏蛋白胨培养基配方百分比计算配制,100 mL,培养基时,，,各种,成份用量,称量：牛肉膏比较黏稠，可用玻璃挑取，称量纸称取，牛肉膏和,蛋白胨,都,易吸潮，称,取时,动作要快速，称后要及时盖上,瓶盖,微生物的实验室培养专业知识专家讲座,第1页,溶化：牛肉膏和称量纸,水,取出,称量,纸,加蛋白胨和,氯化钠,加,琼脂,(,注意,：不停,用玻璃棒搅拌预防糊底而造成烧杯破裂,),补,加蒸馏水至,100 mL,倒平板：待培养基冷却至,50,左右时，在酒精灯火焰附近倒平板,微生物的实验室培养专业知识专家讲座,第2页,2.,注意事项,(1),用天平称量时，注意放等大称量纸，预防牛肉膏粘在托盘上。,(2),在溶化时要用玻璃棒不停搅拌，预防琼脂糊底而造成烧杯破裂。,(3),培养基灭菌后，需冷却至,50,左右时才能倒平板，原因是琼脂在,44,以下凝固。,(4),培养皿打开一条稍大于瓶口缝隙，不要完全打开。,(5),整个操作过程要在酒精灯火焰旁进行，防止杂菌污染。,(6),平板冷凝后要倒置原因,：,预防皿盖上冷凝水落入培养基,，,造成污染,。,(7),若倒平板时，培养基溅在皿盖和皿底之间部位，易滋生杂菌，这个平板应丢弃。,微生物的实验室培养专业知识专家讲座,第3页,一、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基,1.,用文字和箭头写出制备流程,：,。,2.,倒平板是制备牛肉膏蛋白胨固体培养基主要步骤，如图为倒平板操作示意图,。,(1),请用文字和箭头写出正确倒平板操作流程,：,。,(2),甲、乙、丙中灭菌方法,是,。,(3),丁中操作需要,等候,才能,进行。,答案,预习,导,学,挑战,自我 点点落实,平板,冷却凝固,计算,称量,溶化,灭菌,倒平板,丙,乙,甲,丁,灼烧灭菌,微生物的实验室培养专业知识专家讲座,第4页,二、微生物分离与纯化技术,1.,原理,微,生物分离与纯化就是将待检测微生物样品经过划线或涂布接种在固体培养基上，样品中每一个细胞或孢子都能够生长繁殖形成单个菌落。将单个菌落接种到斜面培养基上，经培养后，即可得到一个微生物纯种。,微生物的实验室培养专业知识专家讲座,第5页,2.,方法步骤,微生物分离包含样品稀释、划线或,涂布,及培养三,个步骤。,(1),梯度稀释操作,(,如图,1),将分别盛有,9 mL,水,6,支试管灭菌,，,并,按,10,1,10,6,次序编号。,用移液管吸收,1 mL,培养菌液，注入,10,1,倍稀释试管中。用手指轻压移液管上橡皮头，吹吸三次，使菌液与水充分混匀。,从,10,1,倍稀释试管中吸收,1 mL,稀释液，注入,10,2,倍稀释试管中，重复第,2,步操作。依次类推，直到完成最终一支试管稀释。,注意,：移液管需要经过灭菌。操作时，试管口和移液管应在离火焰,1,2 cm,处。,图,1,微生物分离操作流程图,微生物的实验室培养专业知识专家讲座,第6页,(2),划线或涂布,平板划线法：在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取大肠杆菌培养液在平板上划线，惯用划线方法有平行划线和连续划线两种。平行划线时，每转一个角度烧一次接种环。划线完成后，盖上培养皿盖，做好标识,(,如图,2),。,图,2,划线示意图,微生物的实验室培养专业知识专家讲座,第7页,稀释涂布平板法：取,3,个平板，底面分别用记号笔写上,10,4,、,10,5,和,10,6,三种稀释度，然后用无菌吸管分别吸收对应稀释度稀释液各,0.1 mL,，放入已标识好平板上，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置,5,10 min,，使菌液吸附进培养基,(,如图,3),。,图,3,涂布法示意图,微生物的实验室培养专业知识专家讲座,第8页,(3),培养,将接种后培养基和一个未接种培养基都放入,37,恒温箱中，培养,12 h,和,24 h,后，分别观察并统计结果。,(4),结果分析,确认培养基制备是否合格,为确认培养基制备是否合格，需设置对照试验，即接种后培养基和一个未接种培养基都放入,37,恒温箱中，培养,12 h,和,24 h,，观察现象并统计,假如未接种培养基在恒温箱中保温,1,2 d,后无菌落生长，说明培养基制备是成功，不然试验失败需要重新制备。,微生物的实验室培养专业知识专家讲座,第9页,接种操作成功标准,假如培养基上生长菌落颜色、形状、大小基本一致，并符合该菌菌,落特点,，,则说明接种操作是符合要求,；,假如培养基上出现了其它菌落,，,则说明接种过程中无菌操作还未到达要求，,试验失败，需要,分析原因，再次制备。,微生物的实验室培养专业知识专家讲座,第10页,答案,二、纯化大肠杆菌,1.,接种微生物方法最惯用,有,和,。,2,.,右,图,中甲为平板划线法中最主要步骤,，,乙,为操作结果。每一次划线后要将,接种,环,，,除第一次划线外,，,每一次划线,起点是,，,最终一次,划线,不要和,相连。,3,.,稀释涂布平板法是将菌液进行一系列,，,然后将不一样稀释度菌液分别涂布,到,表面进行培养。,只要,，,就能在培养基表面形成单个菌落。,稀释度,足够高,平板划线法,稀释涂布平板法,灼烧,上一次划线末端,第一区域,梯度稀释,琼脂固体培养基,微生物的实验室培养专业知识专家讲座,第11页,答案,三、菌种保藏,对于频繁使用菌种，能够,采取,法,；对于需要长久保留菌种，能够,采取,法,。,甘油,管藏,暂时保藏,微生物的实验室培养专业知识专家讲座,第12页,预习诊疗,判断正误：,(1),在制备牛肉膏蛋白胨固体培养基过程中，所用灭菌方法是高压蒸汽灭菌法,(,),(2),将培养基从干热灭菌箱内取出马上就能够倒平板,(,),(3),平板划线法和稀释涂布平板法都要在固体培养基上操作,(,),返回,答案,微生物的实验室培养专业知识专家讲座,第13页,答案,思维激活,1.,请简述制备牛肉膏蛋白胨固体培养基过程中几次灭菌过程。,答案,(1),对培养皿进行干热灭菌,；,(,2),对制备成培养基进行高压蒸汽灭菌,；,(,3),倒平板过程中灼烧灭菌,(,酒精灯火焰进行操作,),。,2.,等平板冷却凝固后要将平板倒置，请简述倒置原因。,答案,平板冷却后，皿盖上会有凝结水滴，且培养基表面湿度较高，平板倒置后，既能够使培养基表面水分更加好地挥发，又能够预防皿盖上水滴滴入培养基造成污染。,微生物的实验室培养专业知识专家讲座,第14页,应用示例,1.,制备各种牛肉膏蛋白胨固体培养基,，,关于倒平板详细描述正确是,(,),待培养基冷却至,40,左右时，在酒精灯火焰附近倒平板,将灭过菌培养皿放在桌面上，左手拔出棉塞,右手拿锥形瓶，使瓶口快速经过火焰,用左手拇指和食指完全打开皿盖,右手将锥形瓶中培养基倒入培养皿，左手马上盖上培养皿皿盖,等候平板冷却,5,10 s,，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上,A.,B,.,C.,D,.,解析答案,问题导析,微生物的实验室培养专业知识专家讲座,第15页,问题导析,(1),培养基灭菌后，需冷却,至,左右,时才能倒平板，原因是琼脂在,44,以下凝固。,(2),倒平板过程要,在,附近,进行。,答案,返回上页,酒精灯,火焰,50,微生物的实验室培养专业知识专家讲座,第16页,解析,琼脂是一个多糖，在,98,以上可溶解于水，在,44,以下凝固，倒平板时高于,50,则会烫手，低于,50,时若不能及时操作，琼脂会凝固。无菌操作应贯通于操作全过程，皿盖全打开则空气中微生物会进入培养基。等候平板冷却凝固,(,大约需,5,10 min),后，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上。,答案,C,微生物的实验室培养专业知识专家讲座,第17页,一题多变,倒平板过程需要进行无菌操作，在培养基制备过程中，还有哪些步骤需要进行无菌操作？,答案,要对培养基进行高压蒸汽灭菌，对培养皿进行干热灭菌，酒精灯火焰旁属于灼烧灭菌。,答案,微生物的实验室培养专业知识专家讲座,第18页,思维激活,1.,稀释涂布平板法要求菌液稀释度要足够大，平板划线法要求连续屡次划线，且除了第一次划线外，每一次划线起点是上一次划线末端，两种操作方法即使不一样，但目标相同，该目标是什么？,答案,目标是将菌种充分地分散，确保菌落是由一个细胞或孢子繁殖而成，所取得菌落中菌种是单一纯种。,答案,微生物的实验室培养专业知识专家讲座,第19页,2.,平板划线法中接种环要进行屡次灼烧,(,取菌液前灼烧、每一次划线后灼烧及划线结束后灼烧,),，请简述每次灼烧目标。,答案,取菌液前灼烧目标是防止接种环上可能存在微生物污染培养物；每一次划线后灼烧目标是杀死上次划线结束后接种环上残留菌种，使每次划线菌种都来自上次划线末端；划线结束后灼烧杀死接种环上残留菌种，防止细菌污染环境和感染操作者。,答案,微生物的实验室培养专业知识专家讲座,第20页,以下叙述中，错误是,(,),A.,甲中涂布前要将涂布器灼烧，,冷却,后才能,取菌液,B.,对于浓度较高菌液，假如甲中,稀,释,倍数仅为,10,2,，则所得菌落,不,是,由,单一,细胞或孢子繁殖而成,C.,乙中培养皿中所得菌落都符合要求,D.,乙中连续划线起点是上一次划线末端,应用示例,解析答案,问题导析,2,.,右,图,中甲是稀释涂布平板法中部分操作，乙是平板划线法操作结果。,微生物的实验室培养专业知识专家讲座,第21页,问题导析,(1),对菌液进行稀释时，菌液中菌体浓度越高，则稀释倍数也,要,_,，,菌体浓度低时，则稀释倍数,无须,。,(2),高温会杀死菌体，所以一些经过高温或灼烧灭菌器材,需要,后,才能接触菌种。,(3),平板划线法屡次划线中,，,菌体,_,，,即不一样划线处,_,不一样,，所以形成菌落并非全部是由单个菌体繁殖而成。,答案,返回上页,菌体,数目,越高,太高,冷却,越来越少,微生物的实验室培养专业知识专家讲座,第22页,解析,灼烧后接种环假如没有冷却就接触菌种，会将菌体杀死，,A,正确,；,稀释,倍数过低，会造成多个菌体聚集在一起繁殖成菌落，,B,正确,；,平板划线,法中最终一次划线末端处形成菌落才是由单一细胞或孢子繁殖而成，这种菌落才符合要求，,C,错误,；,连续,划线中，除了第一次划线外，每一次划线起点是上一次划线末端，,目标是使得菌体密度越来越小，确保最终划线末端处菌落是由单一细胞或孢子繁殖而成。,答案,C,微生物的实验室培养专业知识专家讲座,第23页,一题多变,(1),两种接种方法中，假如操作均正确无误，只有稀释涂布平板法才适合对细菌进行计数而平板划线法不能，请简述原因。,答案,只要稀释倍数足够高，则稀释涂布平板法中形成每个菌落都是由单一菌体繁殖而成，即一个肉眼看不见细菌对应着一个能够看见菌落，能够经过统计菌落数目推测出细菌数目。而平板划线法中除了最终一次划线末端处菌落是由单一细菌繁殖而成，其它每个菌落往往是由多个细菌一起繁殖而成，即一个菌落并非对应着一个细菌，所以不适适用于细菌计数。,答案,微生物的实验室培养专业知识专家讲座,第24页,(2),稀释倍数和划线次数是两种接种方法关键，决定稀释倍数和划线次数原因是什么？,答案,决定稀释倍数及划线次数原因是菌液浓度，假如菌液浓度较高则需要高倍数稀释，所划线次数也要较多，不然就能够低倍稀释或降低划线次数。,答案,微生物的实验室培养专业知识专家讲座,第25页,课堂,小结,返回,答案,称量,微生物的实验室培养专业知识专家讲座,第26页,对,点练习,1,2,3,4,解析答案,1.,制备牛肉膏蛋白胨固体培养基步骤是,(,),A.,计算、称量、倒平板、溶化、灭菌,B.,计算、称量、溶化、倒平板、灭菌,C.,计算、称量、溶化、灭菌、倒平板,D.,计算、称量、灭菌、溶化、倒平板,解析,制备牛肉膏蛋白胨固体培养基，应先依据需要计算各成份用量，然后称量、溶化、灭菌、倒平板。,C,微生物的实验室培养专业知识专家讲座,第27页,1,2,3,4,解析答案,2.,平板冷凝后，要将平板倒置，其原因是,(,),A.,接种时再拿起来方便,B.,在皿底上标识日期等方便,C.,正着放置轻易破碎,D.,预防皿盖上冷凝水落入培养基造成污染,解析,平板倒置主要是预防皿盖上水珠落入培养基造成污染。,D,微生物的实验室培养专业知识专家讲座,第28页,解析答案,3.,分离纯化大肠杆菌最惯用方法是平板划线法和稀释,涂布,平板,法。以下相关这两种方法叙述错误是,(,),A.,均将大肠杆菌接种在固体培养基表面,B.,取得每个菌落均是由一个细菌繁殖而来子细胞群,C.,都应在火焰附近进行操作，以预防杂菌污染,D.,稀释分散菌种原理不一样，均能到达分离纯化大肠杆菌目标,解析,用稀释涂布平板法时，假如稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散单个菌落，这个菌落可能是由一个细菌细胞繁殖形成。平板划线中最终一次划线末端处开成菌落才是由单一细胞或孢子繁殖形成，这种菌落才符合要求。,B,1,2,3,4,微生物的实验室培养专业知识专家讲座,第29页,1,2,3,4,4,.,右,表,是从土壤中分离纯化土壤细菌培养基配方。请回答下面问题。,试剂,用量,试剂,用量,牛肉膏,/g,5,琼脂,/g,20,蛋白胨,/g,10,水,/mL,1 000,NaCl/g,5,解析答案,(1),培养基类型很多，但培养基中普通都含有水、碳源、,和无机盐。上述培养基配方中能充当碳源成份是,。培养基配制完成以后，普通还要调整,pH,并对培养基进行,处理。,解析,培养微生物培养基中普通含有水、无机盐、碳源、氮源和生长,因子。牛肉膏、蛋白胨既是碳源又是氮源；培养基在接种前必须灭菌处理,。,氮源,牛肉膏和蛋白胨,灭菌,微生物的实验室培养专业知识专家讲座,第30页,1,2,3,4,(2),分离纯化微生物最常使用接种方法是,和,。,返回,解析答案,解析,微生物接种方法包含平板划线法和稀释涂布平板法两种,。,平板划线法,稀释涂布平板法,(3),假设培养结束后，发觉培养基上菌落连成一片，可能原因是什么？,(,列举两项,)_,。,解析,各种原因都会造成接种菌种密度较大，没有形成单一菌落,。,稀释,倍数不够，菌液浓度太高；划线时，划完第一次没有灭菌又接着划第二次；培养过程灭菌不严格，受到微生物污染,微生物的实验室培养专业知识专家讲座,第31页,