细胞核的分离与纯化及RNA、DNA的定量测定-1201教材课程.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,喻娟娟,生物化学与分子生物学教研室,联系电话,:,15836197257,Email:,yujuan8186,细胞核的分离纯化,及,RNA,、,DNA,的定量测定,实验六,1.,了解细胞核分离纯化的基本原理和方法,2.,掌握,DNA,、,RNA,定量测定的原理及方法,3.,掌握离心机的使用,一、,细胞核的分离与纯化,（上午）,二、,RNA,的定量测定,三、,DNA,的定量测定,（下午）,一、细胞核的分离与纯化,核 酸,核苷酸,磷 酸,碱 基,戊 糖,定糖法（戊糖的差异）,三、核酸的鉴定,浓,HCl,3H,2,O,+,D,核糖,糠醛,糠醛,3,，,5,二羟基甲苯,绿色化合物,RNA,水解,D,核糖,+Pi+A.G.C.U,地衣酚法,:,（,1,）核糖核酸,RNA,的测定,DNA,水解,D,脱氧核糖,+Pi+A.G.C.U,-H,2,O,硫酸,脱氧核糖,羟基,酮基戊醛,蓝色化合物,二苯胺法,:,（,2,）脱氧核糖核酸,DNA,的测定,1,、,0.25mol/L,蔗糖柠檬酸（含,3.3 mmol/L CaCl,2,）称取蔗糖,86g,及,CaCl,2,363mg,，用,1.5,拧檬酸液溶解并稀释至,1000ml,。,2,、,0.88mol/L,蔗糖柠檬酸液（含,3.3mmol/LCaCl,2,）称取蔗糖,301g,及,CaCl,2,363mg,，用,1.5,柠檬酸液溶解并稀释至,1000ml,。,3,、核洗液：即,0.05mol/L,，,TrisHCl,（,pH7.5,）,0.15mol/L NaCl,液。,在,0.2mol/L TrisHCl pH7.5,缓冲液,250ml,中加,NaCl8.7g,再用蒸馏水稀释至,1000ml,。,4,、,1.5,拧檬酸,5,、,0.9,NaCl 6,、,0.02N NaOH,7,、离心机,8,、水浴箱,9,、常规玻璃仪器,试剂与器材,用,颈椎脱臼法,杀死小白鼠后，,迅速剖开腹部取出肝脏,，除去结缔组织，尽快置于盛有,0.9%NaCl,的小烧杯中，反复洗涤，,尽量除去血液,。洗完后,将肝脏一分为二,，每个小组半个肝，直接将半个肝放在小烧杯里剪碎，剪碎的肝脏放入匀浆器中，,加入,1.5,柠檬酸钠溶液,4.5ml,，反复研磨制成匀浆，从而破碎细胞。研磨完后，将匀浆液用,单层纱布进行过滤,，以除去未研碎的组织。,（,1,）肝细胞匀浆的制备,（,2,）分离细胞质和细胞核,将过滤好的匀浆液，放入普通离心机，以,3500r/min,的转速，,离心,15min,。,缓慢倒出上清液,（细胞质），,移入另一试管中，,保留,待测定核酸时使用。,余下的,沉淀物为粗制的细胞核,，加入,0.25mol/L,蔗糖,-,拧檬酸溶液,1ml,，用玻捧搅匀，制成细胞核悬液。,另取离心管一支,，先加入,0.88mol/L,蔗糖,-,柠檬酸液,9ml,，用滴管吸取上述核悬液，,沿管壁缓缓铺于,0.88mol/L,蔗糖,-,柠檬酸溶液液面上，再以,2000r/min,转速,离心,10,分钟，倾去上层液，将管倒立于滤纸上，以吸干余液。,沉淀为初步纯化的细胞核,。,加入,Tris,HCl,NaCl,核洗液,5ml,洗涤沉淀,，以,2000r/min,离心,10min,，除去上层液。得到的,白色沉淀即为纯化的肝细胞核,。,加,5ml 0.02mol/L,的,NaOH,使,细胞核溶解为核液,，保留，待测定核酸。,0.88 mol/L,蔗糖,-,柠檬酸溶液,9ml,核悬液,0.25 mol/L,0.88 mol/L,初步纯化的细胞核,其它的亚细胞结构,半个肝脏,1.5%,柠檬酸溶液,4.5ml,，制成匀浆,单层纱布过滤,1,次,滤液,离心：,3500r/min,；,15min,上清液,（保留！）,沉淀,加入,0.25mol/L,蔗糖柠檬酸溶液,1ml,核悬液,沿壁缓铺于,9ml,0.88mol/L,蔗糖柠檬酸液面上,离心：,2000r/min,；,10min,上清液（弃去）,沉淀,核洗液,5ml,洗涤沉淀,上层液（弃去）,沉 淀,纯化的细胞核,5ml 0.02mol/L NaOH,溶解细胞核,待测样品,鉴定,离心：,2000r/min,，,10min,细胞核的分离与纯化实验流程,试剂（,ml,）,1,2,细胞质液,1.0,-,细胞核液,-,1.0,1mol/LKOH,1.0,1.0,2.,显色与比色：,取试管三支，编号，按下表操作,:,试剂（,ml,）,1,2,空白管,细胞质,RNA,水解液,1.0,-,-,细胞核,RNA,水解液,-,2.0,-,5,三氯醋酸,1.0,2.0,3,5,一二羟基甲苯液,3.0,3.0,3.0,1.,水解：,取试管二支，编号，按下表操作,：,混合各管,沸水浴,(10,min,),冷却,加入,5%,三氯醋酸,(8ml),搅匀后离心,2000r/min,；,5,min,上清液,立即混合各管,沸水浴,(10min),冷却,660nm,比色测定,二、,RNA,的定量测定,试剂（,ml,）,1,2,细胞质液,2.0,-,细胞核液,-,2.0,1mol/L,过氯酸,2.0,2.0,试剂（,ml,）,1,2,空白管,细胞质,DNA,水解液,2.0,-,-,细胞核,DNA,水解液,-,2.0,-,0.5mol/L,过氯酸,2.0,二苯胺试剂,4.0,4.0,4.0,混合各管,冷却,离心,上清液,立即混合各管,冷却,2000r/min;5,min,三、,DNA,的定量测定,2.,显色与比色：,取试管三支，编号，按下表操作,:,1.,水解：,取试管二支，编号，按下表操作,：,沸水浴,(10,min,),沸水浴,(12,min,),595nm,比色测定,表,1.RNA,的定量结果,试管编号,1,（细胞质液）,2,（细胞核液）,原始吸光度值,查标准曲线所得数值,提取液中,RNA,浓度（,ug/ml,）,RNA,占总,RNA,的百分比,提取液中,RNA,浓度（,ug/ml,）,=,显色反应试管中,RNA,含量,稀释倍数,（细胞质液稀释倍数为,10,倍，细胞核液的稀释倍数为,5,倍）,表,2.DNA,的定量结果,试管编号,1,（细胞质液）,2,（细胞核液）,原始吸光度值,提取液中,DNA,浓度（,ug/ml,）,DNA,占总,DNA,的百分比,酸性溶液，取用要小心。,混匀要充分，并且要注意安全，防止液体溢出。,沸水浴操作时，要注意自己和别人的安全。,离心完后，一定先将上清液转出到另一试管，再吸取所需量的水解液。,3.,除了定糖法来测定,DNA,和,RNA,的含量，还有已经学习过的哪种方法也可以用来测定,DNA,和,RNA,的含量？,1.,为什么说本实验的题目不合适？,2.,我们已经学习了电泳法来分离蛋白质，请问我们是否可以用这种方法来分离,DNA,、,RNA,？,实验七,氨基酸的薄层分析,下次实验预习内容,