白色念珠菌菌液制备.doc
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1、白色念珠菌菌液制备:接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml改良马丁培养基中,2328培养2428小时;取此培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml,采用10倍递增稀释法稀释至10-610-7,制成每1ml含菌数50100cfu的孢子悬浮液。黑曲菌菌液制备:接种黑曲菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中,2328培养57天,加入35ml0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱,吸至无菌试管中,取1ml加无菌氯化钠溶液9ml,采用10倍递增稀释法,稀释至10-410-6,制成每1ml含菌数50100cfu的孢子悬液。供试液的制备 无抑菌活性的供试品供试液的制备稀释剂:PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液
2、液体供试品:供试品10ml置锥形瓶中,加90ml稀释剂,混匀,作为供试液(1:10)固体、半固体、粘稠性供试品:称取供试品10g置锥形瓶中,加稀释剂至100ml,混匀后,作为供试液(1:10)。具有抑菌活性的供试品试液的制备当供试品具有抑菌活性时,须先消除抑菌活性,其方法如下:培养基稀释法:取供试液2ml,每0.2ml的供试液注一皿或每0.1ml的供试液注一皿;或取供试液1ml每0.5ml的供试液注一皿,倾注15ml的培养基,测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数,混匀,凝固,培养。每1ml供试液所注的平皿生长的菌数之和即为1ml的菌落数。计算每1ml供试液的平均菌落数,按平皿法技术规则报告菌数。控制菌
3、检查时可加大增菌液的用量。离心沉淀集菌法:取一定量的供试液,3000转/分离心20分钟(供试液如有沉淀,先以500转/分离心5分钟,取全部上清液再离心),弃去上清液,留底部集菌液约2ml,加稀释液补至原量。薄膜过滤法:取规定量试验可能用的最低稀释剂供试液,过滤,冲洗吗,按薄膜过滤法测定其菌落数。中和法:选取适宜的中和剂消除供试品的抑菌活性后测定。菌液组:测定所加的试验菌数。采用平皿法,取试验用的1ml菌液(约50100cfu)分别注入平皿中,立即倾入培养基,每株试验菌平行制备2个平皿,按平皿法测定其菌落数。1.5试验组平皿法:取试验可能用的最低稀释级1ml供试液和50100cfu试验菌,分别注
4、入平皿中,立即倾入培养基,每株试验菌平行制备2个平皿,按平皿法测定其菌落数。1.5.2培养基稀释法(平皿法):取试验可能用的最低稀释级1ml供试液分别注入N个平皿中,每个平皿再注入50100cfu试验菌,分别注入平皿中,立即倾入培养基,每株试验菌平均制备2个平皿,按平皿法测定其菌落数。1.5.3薄膜过滤法:取规定量试验可能用的最低级供试液,过滤,冲洗,在最后一次的冲洗液中加入50100cfu试验菌,过滤,按薄膜过滤法测定其菌落数。至少要一张膜。1.5.4离心沉淀集菌法:取规定量试验可能用的最低稀释剂供试液,如供试液含许多药渣,先以500转/分钟离心35分钟,取全部上清液,再以3000转/分离心
5、20分钟,取下面1ml液体,并用稀释剂洗地管底,将洗涤液与1ml液体一起采用平皿法或薄膜过滤法计数。1.6供试品对照组取规定量供试液,按菌落计数方法测定供试品本底菌数(方法和试验组相同)稀释剂对照组若供试剂需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤法额、等处理时,应增加稀释剂对照组。用稀释剂代替供试品,加入试验菌。最终浓度为每1ml供试液含50100cfu,按试验组的供试液制备方法和技术方法计算。回收率计算试验组回收率计算试验组的菌回收率=菌液组的平均菌落数数供试品对照组平均菌落验组的菌回收率-100%稀释剂对照组回收率计算试验组的菌回收率=菌液组的平均菌落数数稀释剂对照组平均菌落100%计数方法验
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