分子克隆的工具酶.pptx
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1、第二章第二章分子克隆工具酶分子克隆工具酶切割位点可为获得DNA的物理图的特殊的标记利用限制性内切酶切割产生特殊DNA片段的能力使得纯化那些DNA片段成为可能获得的限制性DNA片段可作为DNA操作中的基本介质任何物种都有排除异物保护自身的防御机制免疫系统细菌的限制与修饰系统限制性内切酶限制性内切酶修饰酶修饰酶第一节第一节限制性内切酶限制性内切酶Restrictionendonuclease一、限制与修饰Restrictionandmodification50年代初,发现hostcontrolledspecificity噬菌体具有代表性和普遍性其在不同宿主中的转染频率,在感染某一宿主后,再去感染其
2、它宿主时受到限制的现象。E.coliKE.coliBE.coliCKBCE.coliKE.coliBE.coliCKBC11110-410-410-410-411说明K和B菌株中存在一种限制系统可排除外来的DNA10-4的存活率是由宿主修饰系统作用的结果甲基化:AN6甲基-腺膘呤C5甲基-胞嘧啶2.限制酶的发现限制酶的发现60年代,限制内切酶和限制酶的概念1968年首次从E.coliK中分离限制性内切酶需要ATP,S-腺苷甲硫氨酸(SAM)等有特定的识别位点但没有特定的切割位点切割位点远离识别位点1000bp以上1970年美国约翰霍布金斯大学H.Smith偶然发现流感嗜血杆菌(Haemophi
3、lus influenzae)能迅速降解外源的噬菌体DNA细胞提取液可降解E.coliDNA但不能降解自身DNA即HindII酶5.GTPyPuAC.33CAPuPyTG.5GTCGACGTTAACGTCAACGTTGACYRPy表示嘧啶,Pu表示嘌呤5.GAATTC.33CTTAAG.5EcoRI3.限制酶的命名限制酶的命名宿主宿主属名第一字母、种名头两个字母属名第一字母、种名头两个字母菌株或型号菌株或型号序号序号罗马字罗马字HindIIEcoRI例如:例如:Hin Hin d d H Haemophilus aemophilus ininfluenzaefluenzae(流感嗜血杆菌),(
4、流感嗜血杆菌),:表示菌系为型血清型;:表示菌系为型血清型;:表示分离到的第三个限制酶。:表示分离到的第三个限制酶。EcoEco RIRIE Escherichia scherichia cocolili RIRI EcoRIEcoRI表示基因位于表示基因位于Escherichia coliEscherichia coli中的抗药性中的抗药性R R质粒上质粒上 HinHin ddH Haemophilusaemophilus ininfluensae fluensae d d SacSac I(II)I(II)Streptomyces achromogenes I I()第第类酶类酶(切割部位
5、无特异性切割部位无特异性):如EcoB(大肠杆菌B株)、EcoK(大肠杆菌K株)分子量较大(约300000),作用时需ATP、Mg+等辅助因子第第类酶(切割部位有特异性类酶(切割部位有特异性):如EcoRI(大肠杆菌)、Hind(嗜血杆菌),分子量较小(约20000-100000),作用时需Mg+存在4 4、限制性内切酶的分类:、限制性内切酶的分类:III类 识别位点严格专一(不是回文序列):切点不专一,往往不在识别位点内部。NEB;Invitrogen公司;promega普洛麦格;TakaRa.二、限制酶的识别序列二、限制酶的识别序列2 2、识别特定碱基顺序、识别特定碱基顺序:2 2、1 1
6、 回文对称序列回文对称序列(palindrome,从两个从两个方向阅读其序列相同的方向阅读其序列相同的序列)。序列)。1、限制酶识别序列长度4,5,6个碱基对。4 碱基酶识别位点在DNA分子中的频率 6 碱基酶 稀有切割限制酶R=A or G Y=C or T M=A or C K=G or T S=C or G W=A or TH=A or C or T B=C or G or T V=A or C or G D=A or G or TN=A or C or G or T EcoRI5-GAATTC-33-CTTAAG-53 3、型限制性核酸内切酶的切割方式型限制性核酸内切酶的切割方式 切点
7、大多数在识别顺序之内切点大多数在识别顺序之内 限制酶切后产生两个末端,末端结构是限制酶切后产生两个末端,末端结构是-和和-CCTCAGCGGAGTCGBbvcI I三、限制酶产生的末端种类三、限制酶产生的末端种类 1.1.粘性末端粘性末端 )-端突起,端突起,)-端突起,个数为或个核苷酸端突起,个数为或个核苷酸2.平末端平末端SmaI5-CCCGGG-35-CCCGGG-33-GGGCCC-53-GGGCCC-5在对称轴上同时切割DNA的两条链 HaeIIIGGCC EcoRVGATATC XmnIGAANNNNTTC3.非对称突出端非对称突出端来自非对称识别序列来自非对称识别序列CCTCAG
8、CBbvCIGGAGTCG简并序列AccIGT/MKACGTATACGTAGACGTCTACGTCGAC间隔序列DraIIICACNNNGTGEarICTCTTC(1/4)GAGAAG4.同裂酶同裂酶1.定义:能识别相同序列但来源不同的两种或多定义:能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制酶种限制酶2.特点:特点:1)识别相同顺序)识别相同顺序2)切割位点的异同)切割位点的异同 KpnIGGTACCAsp718GGTACC SstICCGCGGSacICCGCGG同序同切这些酶识别序列和切割位置都相同HindIIHincIIGTY/RACHpaIIHapIIC/CGGMobISau3AI/GA
9、TC同序异切KpnIGGTAC/CAcc65IG/GTACCAsp718IG/GTACCAatIIGACGT/CBsaHIGR/CGYC识别的序列是相同的,但它们的切割位点不同“同功多位”EcoRIG/AATTCApoIR/AATTYHpaIGTT/AACHincIIGTY/RAC许多识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能。如EcoR识别和切割位点为GAATTC,Apo识别和切割位点为RAATTY,后者可识别前者的序列。其它SalIG/TCGACAccIGT/MKACHincIIGTY/RAC许多不同的限制酶来源各异,识别的靶子序列也各不相同,但切割DNA产生的末端是相同的,且是对称的,
10、即它们可产生相同的粘性突出末端。这些酶统称为同尾酶。这些酶切割DNA得到的产物可进行粘端连接。5 5、同尾酶(、同尾酶(isocaudamerisocaudamer):):GATC 4个核苷酸组成的粘性末端平端同裂酶四、四、DNA末端长度对限制酶切割的影响末端长度对限制酶切割的影响限制酶切割DNA时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求,也就是说在识别序列两端必须有一定数量的核苷酸,否则限制酶将难以发挥切割活性。双酶切PCR产物2hr20hrAccICCGGTCGACCGG00HindIIICAAGCTTG00CCAAGCTTGG00CCCAAGCTTGGG10%75%EcoRIGGAATTC
11、C9090PstI GCTGCAGC00TGCACTGCAGTGCA1010AACTGCAG(N)149090CTGCAG(N)20001、保护碱基 限制性内切酶识别特定的DNA序列,除此之外,酶蛋白还要占据识别位点两边的若干个碱基,这些碱基对内切酶稳定的结合到DNA双链并发挥切割DNA作用是有很大影响的,被称为保护碱基。PCR引物设计时,为保护5端外加的内切酶识别位点,使酶切完全而添加.比如设计引物5端导入酶切位点的时候,一般导入34个;导入的碱基,最好是A/G/C/T比较平均,并能部分平衡整个引物的GC%和Tm;G/C为主,可以使引物5形成所谓GC Clamp(有的软件,认为这样好).别的
12、就没什么了.加几个和加哪几个的问题 http:/ 载体的酶切位点也会碰到,相临的2个酶切位点往往不能同时使用,因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoIEcoRIPstIEcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficiency XhoI97%1base PstI37%1base.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoIEcoRIPstIEcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficiency X
13、hoI97%1base PstI37%1base.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoIPstIEcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficiency XhoI97%1base PstI37%1base.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoI PstIEcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficiency XhoI97%1base PstI37%1base.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoI Pst
14、IEcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficiency XhoI97%1base PstI37%1base.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoIPstIEcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficiency XhoI97%1base PstI37%1baseEcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficiency XhoI97%1base PstI37%1base.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoIPstIEcoR
15、IinitialcutL1TMUS29cleavageefficiency XhoI97%1base PstI37%1base.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoIEcoRIPstIXhoI:1 EcoRI100%PstI:1 EcoRI88%五、位点偏爱(sitepreferences)单位酶:在建议使用的缓冲液及温度下,在20l反应液中反应1小时,使1gDNA完全消化所需的酶量DNA某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割,即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱。*1975EcoRI切割phage(Lamb
16、da)中的5个位点,并不是随机的,靠近右端的位点,比分子中间的位点切割快10倍。1.现象*有4个SacII位点三个在中央一个在右臂(Right-terminus)at40,386中央三个快50倍NEB检测了许多限制酶,有许多酶的差异在10倍的范围上,但有许多酶有较大的差异,如NarI,NaeISacIIGGCGCC,GCCGGC,CCGCGG(1)pBR322含4个NarI位点1单位酶1hr(标准条件)将两个位点完全切割但是另外两个位点50单位,16小时不能完全切割完全(2)NaeI在pBR322也有4个位点,其中两个易切割,有一个有点慢,第四个慢50倍。在DNA上NarI和NaeI各都有一个
17、位点,但是过量的酶只能完成部分酶切。2.原因(1)在切割DNA之前需要同时与两个识别位点相作用plasmidPlasmid/SalIPlasmid/EagI六、酶切反应条件任何一个提供商都会标明其产品的最佳作用条件(一)缓冲液1.常规缓冲液pH,Mg+,DTT,BSA(10X)Mg2+的作用是提供二价的阳离子。巯基试剂对于保持某些核酸内切限制酶的稳定性是有用的,而且还可保护其免于失活。pH7.0-7.9(at25)Tris-HCl,乙酸Tris-HCL的作用在于,使反应混合物的pH恒定在酶活性所要求的最佳数值的范围之内。离子强度:NaCl高中低100mM50mM0Mg+10mMMgCl2,Mg
18、AcDTT(dithiothreitol,二硫苏糖醇)1mM100g/mlBSA少数需要不同酶具有不同Buffer各公司设立几种常用BufferNEBuffer1NEBuffer2NEBuffer3NEBuffer4BufferABufferBBufferHBufferLRoche对DNA进行双酶切时,如何选择缓冲液是相当重要的。一方面可选用都合适的缓冲液或通用缓冲液;若找不到共用的缓冲液则先用低浓度的,再加适量NaCl和第二种酶;或先用低盐缓冲液再用高盐缓冲液(DNA可纯化或不纯化)。2.通用缓冲体系Phamacia法玛西亚One-Phor-Allbufferplus,OPA+3.注意事项a
19、.取少量酶(方法or稀释)b.最后加酶、尽快操作c.减少反应体积d.反应时间的延长e.分装(对于多个反应)(二)反应温度大多数为37一部分为50-65少数25-30高温作用酶于37时活性多数10-50%TaqI(65)10%,ApoI(50)50%(三)反应时间1hrormore许多酶延长其反应时间可减少酶的用量16hrEcoRI0.13(1/8)HindIII(1/8)KpnI(1/4)BamHI(1/2)HaeIII(1/1)(四)反应终止1.EDTA终10mMEDTA可鏊合镁离子,从而可终止酶切反应2.加热37酶6520minotherwise8020min不失活在8020min的酶37
20、:Bg1IIHpaIPvuII65:Tth111ITspRI50:Bc1I3.其它DNA纯化(苯酚,试剂盒)七、星星活性(staractivity)非特异性切割在极端非标准条件下,限制酶能切割与识别序列相似的序列,这个改变的特殊性称星星活性1.概念实际上星星活性是限制内切酶的一般性质,任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点。ApoI、AseI、BamHI、BssHII、EcoRI、EcoRV、HindIII、Hinf1、KpnI、PstI、PvuII、SalI、ScaI、TaqI、XmnI2.酶的特异性变化方式与酶的种类和所应用的条件有关最普遍的活性变化1个碱基的变化识别位点外层碱
21、基的随意性以及单链缺口3.引起星星活性的因素高浓度甘油(5%)酶过量(100U/g)低离子强度(pH8.0)有机溶剂PMSD(二甲基亚砜)、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺(dimethylacetamide)、二甲基甲酰胺(dimethylformamide)、sulphalane用其它二价阳离子代替Mg+Mn+,Cu+,Co+,Zn+不同的酶对上述条件的敏感性不一样PstI比EcoRI对高pH更敏感但后者对甘油浓度更敏感星星活性在绝大多数情况下,是可控制的4.抑制星星活性的条件(措施)减少酶的用量,避免过量酶切,减少甘油浓度保证反应体系中无有机溶济或乙醇提高离子强度到100150mM(如果不会抑
22、制的话)降低反应pH至pH7.0使用Mg+作为二价阳离子1.外因外因外因是可预见和控制的,如反应条件、底物的外因是可预见和控制的,如反应条件、底物的纯度(是否有杂质、是否有盐酚的污染)、何时纯度(是否有杂质、是否有盐酚的污染)、何时加酶、操作是否恰当、反应体积的选择以及反应加酶、操作是否恰当、反应体积的选择以及反应时间的长短等等。时间的长短等等。九、影响活性的因素九、影响活性的因素2.“内因内因”位点偏爱性位点偏爱性 甲基化甲基化 底物的构象底物的构象构象的影响主要指切割线性DNA和超螺旋DNA时的活性,如与切割DNA相比,EcoR、Pst、Sal需要至少2.5-10倍的酶来切割pBR322的
23、超螺旋DNA。PaeRT与Xho切割相同的序列(CTCGAG),但如果5端为CT则 PaeRT不能切割。十、十、酶切位点的引入(酶切水平)1.产生的产生的5突出端补平后连接突出端补平后连接EcoRIGAATTCCTTAAG.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoIEcoRIPstI.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoIPstI.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoI PstI.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.Xho
24、I PstI.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoI PstIAATTTTAA.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoI PstIAATTTTAA.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoI PstIAATTTTAAAceIATTAATXmaIGAANNNNTTC2.同尾末端的连接同尾末端的连接BamHI(G/GATCC)+BclI(T/GATCA)AlwI(GGATC4/5)3.平端连接平端连接PvuII(CAGCTG)+EcoRV(GATATC)MobI(GA
25、TC)十一、十一、酶切位点在基因组中分布的不均一性GC%酶切位点出现的机率BamHIGGATCCEcoRIGAATTC在基因组中,碱基对的排列是非均匀的因此尽管GC含量相同的酶切位点,在基因组中出现的机率是不一样的平均片段大小在E.coliAscI(GGCGCGCC)20kbNotI(GCGGCCGC)200kbEcoRI/HindIII5kbSpeI(ACTAGT)60kb细菌基因组在大多数富含A+T的细菌中,CCG和CGG的排列是最少见的,所以含有这两种序列的识别序列出现的机率就非常少酵母基因组G+C%为38%,因此在重复序列之外(tRNAorTyelements),富含G+C的识别序列就
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