高效液相色谱结果分析.pptx
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1、高效液相色谱高效液相色谱结果处理与分析结果处理与分析第二部分第二部分(High performance Liquid Chromatography,HPLC)一、色谱数据处理一、色谱数据处理二、色谱图二、色谱图三、色谱图名词术语三、色谱图名词术语四、色谱峰检测四、色谱峰检测五、五、HPLCHPLC测定步骤与内容测定步骤与内容一一.色谱数据处理色谱数据处理检测器检测器记录仪记录仪积分仪积分仪色谱工作站色谱工作站色谱仪信号输出图色谱仪信号输出图l色色谱谱数数据据处处理理是是通通过过ADCADC转转换换器器,把把模模拟拟信信号号转转换换成成数数字信号字信号,然后采用色谱软件处理给出然后采用色谱软件处
2、理给出色谱图色谱图等信息。等信息。l数据处理原理数据处理原理自动处理自动处理人工修正人工修正 峰的检测峰的检测 数据采集数据采集 基线校正和重叠峰的分离基线校正和重叠峰的分离 l数据处理方法数据处理方法l色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图曲线图,其纵坐标为信号强度其纵坐标为信号强度,横坐标为时间横坐标为时间二二.色谱图色谱图(Chromatogram)样品组分分离示意图样品组分分离示意图三三.色谱图名词术语色谱图名词术语(1)(1)l色色谱谱峰峰(Peak):(Peak):色色谱谱柱柱流流出出组组分分通通过过检检测测器器时时产
3、产生生的的响响应信号应信号.l峰底峰底(Peak Base):(Peak Base):峰的起点与终点之间连接的直线峰的起点与终点之间连接的直线.l峰高峰高(Peak Height):(Peak Height):峰最大值到峰底的距离峰最大值到峰底的距离.色谱峰色谱峰时间时间(分分)峰高峰高峰底峰底响应值响应值(mV)基线基线l切线峰宽切线峰宽(Peak Width,峰宽峰宽):):在峰两侧拐点处所作切线在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离与峰底相交两点之间的距离.l半半峰峰宽宽(Peak Width at Half Height):):通通过过峰峰高高的的中中点点作作平平行行于于峰峰底
4、底的的直直线线,此此直直线线与与峰峰两两侧侧相相交交两两点点之之间间的的距距离离.l峰面积峰面积(Peak Area):(Peak Area):峰与峰底之间的面积峰与峰底之间的面积,又称响应值又称响应值.三三.色谱图名词术语色谱图名词术语(2)(2)色谱峰的判断色谱峰的判断 (最小面积最小面积)响应值响应值时间时间峰面积峰面积切线切线半峰宽半峰宽切线峰宽切线峰宽三三.液相色谱图名词术语液相色谱图名词术语(3)(3)l保保留留时时间间(T(TR R)(Retention)(Retention time):time):组组分分从从进进样样到到出出峰峰最最大大值所需的时间值所需的时间.l死死时时间间
5、(t(t0 0)(Dead)(Dead time):time):不不被被固固定定相相滞滞留留组组分分的的出出峰峰时时间间.(其其测测定定测测定定通通常常是是使使用用不不被被柱柱子子保保留留而而又又有有紫紫外外吸吸收收的的惰惰性性物物质质,例例如如:正正相相色色谱谱常常用用四四氯氯化化碳碳,反反相相色色谱谱常用常用甲醇、尿嘧啶、甲醇、尿嘧啶、NaNO3NaNO3等)等).l调整保留时间:调整保留时间:t tR R t tR Rt t0 0l保保留留体体积积(V(VR R)(Retention)(Retention volume):volume):组组分分从从进进样样到到出出现现峰最大值所需的流动
6、相体积峰最大值所需的流动相体积.l死死体体积积(V V0 0)(Dead)(Dead volume):volume):不不被被固固定定相相滞滞留留的的组组分分,从进样到出现峰最大值所需的流动相体积从进样到出现峰最大值所需的流动相体积.l调整保留体积:调整保留体积:V VR RV VR RV V0 0t tR R F FC C lF Fc c:流动相的流速流动相的流速 mL/min.mL/min.三三.液相色谱图名词术语液相色谱图名词术语(4)(4)l谱谱带带扩扩展展(Band(Band Broadening):Broadening):由由于于纵纵向向扩扩散散,传传质质阻阻力力等等因因素素的的影
7、影响响,使使组组分分在在色色谱谱柱柱内内移移动动过过程程中中谱谱带带宽宽度增加的现象度增加的现象.三三.液相色谱图名词术语液相色谱图名词术语(5)(5)三三.液相色谱图名词术语液相色谱图名词术语(6)(6)l拖尾峰拖尾峰(Tailing Peak):(Tailing Peak):后沿较前沿平缓的不对称峰后沿较前沿平缓的不对称峰.l前伸峰前伸峰(Leading Peak):Leading Peak):前沿较后沿平缓的不对称峰前沿较后沿平缓的不对称峰.l鬼峰鬼峰(Ghost Peak):Ghost Peak):并非由试样所产生的峰并非由试样所产生的峰,亦称假峰亦称假峰.Excellentt=1.0
8、-1.05Acceptablet=1.2Unacceptablet=2Awfult=4正常前伸三三.液相色谱图名词术语液相色谱图名词术语(7)(7)l基基线线(Baseline):Baseline):在在正正常常操操作作条条件件下下,仅仅由由流流动动相相所所产产生生的响应信号的响应信号.l基基线线噪噪声声(Baseline(Baseline Noise):Noise):由由各各种种因因素素所所引引起起的的基基线线波动波动.l基基线线飘飘移移(Baseline Baseline Drift):Drift):基基线线随随时时间间定定向向的的缓缓慢慢变变化化.基线基线基线噪音基线噪音基基线线飘飘移移
9、峰宽半峰宽标准偏差l标标准准偏偏差差()(Standard()(Standard deviation):deviation):0.6070.607倍倍峰峰高高处处峰峰宽宽的的一一半半,为为便便于于测测量量,改改用用半半峰峰宽宽。目目的的是为了计算柱效率是为了计算柱效率(柱效柱效)。l柱效柱效(理论塔板数)(理论塔板数):或或三三.液相色谱图名词术语液相色谱图名词术语(8)(8)进样进样图示中塔板数为图示中塔板数为3.3.l 塔板理论塔板理论 类似蒸馏中的气液平衡类似蒸馏中的气液平衡l峰峰的的检检测测和和判判别别是是依依据据在在基基线线的的讯讯号号水水平平上上,预预设设一一个个“阈阈值值”,超超
10、过过该该值值时时,判判别别为为峰峰可可开开始始检检测测。一一般般采采用下面两种方式判别峰讯号的变化:用下面两种方式判别峰讯号的变化:依依照照信信号号斜斜率率的的变变化检测信号化检测信号依依照照积积分分面面积积检检测测峰信号峰信号四四.色谱峰检测色谱峰检测切线 色谱峰的判断 最小面积五五.HPLC 测定步骤与内容测定步骤与内容1.1.确确定定色色谱谱条条件件:色色谱谱柱柱的的选选择择,流流动动相相、流流速速、检测波长、柱温及进样量等。检测波长、柱温及进样量等。2.2.绘制标准工作曲线绘制标准工作曲线3.3.精密度试验与回收率试验精密度试验与回收率试验4.4.实际样品含量测定实际样品含量测定1.1
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