菌种管理程序.doc

菌种管理程序

1 目的
保证菌种合理、有效地使用和保存，保证实验室和社会的生物安全。
2 菌种的类型及用途
2.1 质控菌株的用途及来源：质控菌株主要包括标准菌株（购买于国家菌种保藏中心）和室间质评标本分离株（广东省临检中心和卫生部临检中心）；标准菌株均为ATCC菌株，主要用于药物敏感试验和菌株鉴定试剂的室内质控，如VITEK2-compact微生物鉴定及药敏分析仪检测板、K-B法药敏试验等的质控。室内质量控制使用的主要菌株见表1-11-1。

表1-11-1 室内质量控制使用的主要菌株一览表
菌种名称
菌种代码
菌种用途
金黄色葡萄球菌
ATCC29213
1．β-内酰胺酶试验阳性质控
2．触酶试验阳性质控
金黄色葡萄球菌
ATCC25923
1．葡萄球菌K-B法药敏试验质控2．革兰染液质控
3．GP67药敏板质控
4．血平板／伊红美蓝／营养琼脂平板培养基质控
5．触酶试验阳性质控
大肠埃希菌
ATCC25922
1.GN13药敏板质控
2．革兰／抗酸染液质控
3．伊红美蓝／营养琼脂平板培养基质控
4．氧化酶试剂阴性质控
5．ESBL试验阴性株质控
6．肠杆菌K-B法药敏试验质控
粪肠球菌
ATCC29212
1．GP67药敏板质控
2．β-内酰胺酶试验阴性质控
铜绿假单胞菌
ATCC27853
1．营养琼脂平板培养基质控
2．非发酵菌K-B法药敏质控
3．氧化酶试剂阳性质控
肺炎克雷伯菌肺炎亚种
ATCC700603
1．ESBL试验阳性株质控
阴沟肠杆菌
ATCC700323
GN鉴定板质控
铅黄肠球菌
ATCC700327
GP鉴定板质控

2.2 临床分离株：日常工作中的临床分离株，可按需要留取菌种保存，主要应用于流行病学调查和科研等。
3 菌株的保存方法
3.1 平板4℃保存法：此法只适合短期保存，可用于每周转种的质控参考菌株的保存，方法是将要用的菌株转种于相应的平板上，在平板背面标上转种日期与相应菌名，放入保鲜盒内保存，1个月后高压处理。
3.2 甘油肉汤快速冷冻法：适用于一般细菌，可保持细菌1～3年的活性和生物学特性不变。方法是将对数生长期的细菌（分纯培养18～24h）刮取放入含10%～15%的试剂级的甘油高营养肉汤中，放在－70℃低温冰箱，使菌悬液迅速冻结。
3.3 干燥冷冻法：适用于一般细菌，此法可中期保存细菌。方法是用厚的无菌滤纸片（至少2片）从平皿上刮取分纯的细菌苔放入灭菌Eppendorf管中，在保存管盖上记录菌株编号，侧面记录登记本编号和菌株名，先置－20℃以下冰冻保存，待菌种保存盒满后，再移入－70℃冰箱保存。
4 菌株的分类保存
4.1 标准菌株：从国家菌种保藏中心购买的ATCC菌株，以干粉形式冰冻保存，购回后将之按顺序放于保存盒内（保存盒的编号为1～10组成），在《东莞市桥头医院检验科菌株保存记录表》进行登记，并附有各菌株的购买时间及代数。
4.2 室间质评分离株：实验室从广东省与国家卫生部临检中心的室间质评活动中分纯的已知菌株，根据不同的菌株采取合适的保存法，放置于室间质评分离菌专用的保存盒（保存盒的编号为11～20组成），并在《东莞市桥头医院检验科菌株保存记录表》进行登记。
4.3 临床分离株：可根据G－菌、G＋菌、苛氧菌和真菌归类保存，不同菌按不同的保存方法进行留取于灭菌Eppendorf管中，并做好标识，按顺序放入菌株保存盒内（保存盒的编号由××菌第×盒，每类菌的盒号均由1号开始），先置－20℃以下保存，待盒满后转入－70℃冰箱保存。
5 菌株复苏与使用
5.1 干燥冷冻法保存的菌株：用无菌镊子取出纸片1片，贴在相应的培养基上片刻后，接种划线。菌种取完后立即放回冰箱保存。
5.2 标准菌株
5.2.1 每年年初由－70℃冰箱取出干粉，从中挑出少许放入100μl肉汤中，静置5min，待其完全溶解后混匀，再接种至相应培养基平板。
5.2.2 对于非苛氧菌株的使用是每月的第1周从－20℃冰箱中取出（每种菌株）1支，用接种环取1环菌苔转种至相应的培养基平板复苏后使用。生长有菌落的培养基平板标上日期和菌株编号，放入保鲜盒内于4～8℃冰箱保存，使用时从保鲜盒内的平板中转种菌株做鉴定药敏等质控，1个月后高压灭菌丢弃。对于苛氧菌株的使用是每周一从－20℃冰箱中取出（每种菌株）1支，无须解冻，直接用接种环取1块后于相应培养基平板上直接划线接种复苏后伎用，l周后高压灭菌丢弃。以上行为均应在《东莞市桥头医院检验科标准／质控菌株保存和复苏记录表》中记录。苛氧菌株取出转种后的Eppendorf管应立即放回－20℃冰箱保存，非苛氧菌株的Eppendorf管放入4～8℃冰箱保存（可供转种菌株不能存活时重转，注意药敏试验质控菌株不要反复冻溶）。
6 菌株使用、保存的注意事项
不能用含有可发酵糖的培养基保存菌株；不可从选择性培养基或从药敏试验平板培养基上留取菌株；不可从干枯培养基上取菌保存。菌株保存容器需密封、安全；温度变化敏感的细菌，如淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌，可用快速冷冻法长期保存。不可连同培养基直接贮存于冰箱作短期保存；作为抗菌药物敏感试验质控用的参考菌株，由保存状态取出后，不能连续使用1周以上，应定期传代，但一般不超过6次；非干粉保存的菌株注意定时转种。
7 菌株的销毁
7.1 销毁保存菌株须经科主任批准，并在《东莞市桥头医院检验科菌株销毁登记表》上写明销毁原因与方式等。
7.2 用于室内质控的保存菌种传代或移种后，销毁原菌种之前应仔细检查新旧菌的标签是否正确。
7.3 菌种销毁时，应放置灭菌指示标志，以确认灭菌效果，必要时进行灭菌效果验证，如炭疽杆菌、肉毒梭状芽胞杆菌和破伤风梭状芽胞杆菌等有较强抵抗力和强致病性的芽胞菌株，应对其进行间歇性灭菌。杀死全部芽胞的方法是将第1次高压灭菌处理物品放37℃孵箱培养，使芽胞繁育成繁殖体，再进行第2次高压灭菌处理。
8 菌种的管理
8.1 菌种应经严格鉴定合格后方可入库，菌种保存冰箱需上锁，实行双人共管，由微生物科主任助理和科主任指派的人员共同保管，并定期进行全面检查，对进出库的菌种必须清点与登记，不可有差错；质控菌株的每年分装工作由菌株保管人完成，防止在传代过程中污染。所有需保存的菌株在《东莞市桥头医院检验科菌株保存记录表》中记录，并输入电脑以电子版形式存档，以便查找。
8.2 在菌种的保存盒上应有明显的标签，且标签应耐水与耐低温，不可因字迹模糊而导致菌种的错误。保存菌株进出库需在《东莞市桥头医院检验科菌株出入库记录表》中登记。
8.3 用于药敏试验的质控菌株每次出库转种均在《东莞市桥头医院检验科标准／质控菌株保存和复苏记录表》中进行记录，质控频率为每日1次的质控菌株可从复苏菌株中每天传代使用。非保管人员不得从菌株库中存取菌株。
8.4 未经科主任批准，任何人不得以任何理由将菌株带出微生物实验室。
8.5 需外送转运的菌株经科主任批准后，填写《东莞市桥头医院检验科菌株转运记录表》备案。
8.6 质控菌株与室间质评分菌株在每年分装时的复苏保存情况，要在《东莞市桥头医院检验科标准／质控菌株保存和复苏记录表》中进行记录。
8.7 菌种销毁需经科主任批准，并在《东莞市桥头医院检验科菌株销毁登记表》中登记。

东莞市桥头医院检验科菌株保存记录表
部门：微生物室 表格编号：
存放盒号： 菌株入库日期： 存放处：－70℃冰箱

注：菌株存放盒的存放起始位置为左上角第1格，存放顺序为横轴方向，每格内填写内容为菌株的编号和菌名及耐药特点

东莞市桥头医院检验科菌株出入库记录表
部门：微生物室 表格编号：
菌株序号
菌株名称
传代数
出库日期/数量
入库日期/数量
库存量
用途
操作者

东莞市桥头医院检验科标准／质控菌株保存和复苏记录表
部门：微生物室 表格编号：
复苏日期
菌株名称
保存温度
是否存活
传代次数
复苏后作用
复苏后处理
操作者

东莞市桥头医院检验科菌株转运记录表
部门：微生物室 表格编号：
菌株序号
菌株名称
传代数
转运地点
转运日期/数量
用途
审批者
申请者
接收人

东莞市桥头医院检验科菌株销毁登记表
部门：微生物室 表格编号：
日期
菌株名称与编号
数量
批准人
执行人
销毁方式
记录者
备注