一抗、二抗的选择.ppt
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1、一抗、二抗的选择一抗的选择n n1.分析实验应用类型WB(WesternBlot免疫印迹)IHC(immunohistochemistry免疫组织化学)ELISA(enzyme-linkedimmunoadsordentassay酶联免疫吸附试验)n n2.样本蛋白的结构性质样本蛋白的结构域样本蛋白的结构域全长蛋白、蛋白片段、多肽、全长蛋白、蛋白片段、多肽、细菌、细胞细菌、细胞样本的提取和处理过程样本的提取和处理过程uu某些抗体要求样本经过某些特殊处理,某些抗体要求样本经过某些特殊处理,例如:许多抗体只识别还原和变性的、例如:许多抗体只识别还原和变性的、表位已暴露不受二级四级结构阻碍的表位已暴
2、露不受二级四级结构阻碍的蛋白样本,蛋白样本,uu某些抗体仅识别天然折叠状态的蛋白。某些抗体仅识别天然折叠状态的蛋白。当选择免疫组化的抗体时,应注意某当选择免疫组化的抗体时,应注意某些抗体只识别未固定的冷冻的组织,些抗体只识别未固定的冷冻的组织,uu另一些抗体则适用于无需抗原修复解另一些抗体则适用于无需抗原修复解交联步聚的甲醛固定石蜡包埋的组织,交联步聚的甲醛固定石蜡包埋的组织,蛋白片断或一种特殊的同型物或蛋白全长的某一区域用含此片段域的免疫原制备出的抗体。用FACS流式检测活细胞的表面蛋白用含该表面蛋白的胞外域来免疫制备的抗体。n n3.样本的物种选择物种相同或有交叉反应的抗体,抗体可能与不同
3、物种的同种靶蛋白有交叉反应,因其氨基酸序列同源性较高,如果样本的种类未列入抗体说明书上的交叉反应种属表中,并不意味着该抗体不适用于检测该物种的蛋白,而只是表示该物种尚未用此抗体检测验证过,应通过序列比对的方法来预测交叉反应,可应用Expasy和NCBIBLAST来进行不同物种蛋白同源性比对。n n4.4.一抗宿主物种的选择一抗宿主物种的选择n n一般说来,在使用偶联二抗结合无偶联物的一抗时,一抗一般说来,在使用偶联二抗结合无偶联物的一抗时,一抗宿主动物的物种选择较为重要,对于免疫组化而言,尽可宿主动物的物种选择较为重要,对于免疫组化而言,尽可能选择与样本不同种系物种的一抗,从而避免二抗与样本能
4、选择与样本不同种系物种的一抗,从而避免二抗与样本内源性免疫球蛋白产生交叉反应,内源性免疫球蛋白产生交叉反应,n n例如:检测小鼠样本蛋白,则不应选择小鼠或大鼠源的一例如:检测小鼠样本蛋白,则不应选择小鼠或大鼠源的一抗,最好选兔源的一抗,则二抗则可选择偶联了检测分子抗,最好选兔源的一抗,则二抗则可选择偶联了检测分子(酶、荧光素、生物素等)的抗兔(酶、荧光素、生物素等)的抗兔IgGIgG。n n如果选择有偶联物的一抗则不适用上述情况,除免疫组化如果选择有偶联物的一抗则不适用上述情况,除免疫组化外的其它对不含内源性免疫球蛋白样本的检测方法,则抗外的其它对不含内源性免疫球蛋白样本的检测方法,则抗体宿主
5、物种的影响不大,如对不含体宿主物种的影响不大,如对不含IgGIgG的细胞裂解物样本的细胞裂解物样本的的westernblottingwesternblotting检测,尽管如此,含有血清的组织裂检测,尽管如此,含有血清的组织裂解物和组织培养上清中含有免疫球蛋白,还原变性样本中解物和组织培养上清中含有免疫球蛋白,还原变性样本中含含IgGIgG,在,在westernblotwesternblot检测中则结合出现检测中则结合出现IgGIgG分子分子50and25kDa50and25kDa的重链和轻链条带。的重链和轻链条带。二抗的选择n n1.一抗的种属来源二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源,n n
6、2.二抗的种属来源uu一般来说,不同的种属来源与二抗的质量没有必然的联系,来源于山羊的二抗与来源于驴的二抗在一般的实验里没有太多的差别。uu在一些特殊的实验里,如双标实验里,如果其中一个一抗是山羊来源的,一个是小鼠来源的,则相应的二抗分别要抗山羊和抗小鼠的二抗,这时候,二抗就不能选择山羊或者小鼠来源的。n n3二抗的偶联标记主要有酶(辣根过氧化酶主要有酶(辣根过氧化酶HRPHRP和碱性磷酸酶和碱性磷酸酶APAP或其衍或其衍生物生物APAAPAPAAP,PAPPAP),荧光基团(),荧光基团(FITCFITC、RhodamineRhodamine、TexasRedTexasRed、PEPE、Rh
7、odamineRhodamine、DylightDylight等)、生物素、等)、生物素、金颗粒。金颗粒。选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。uu对于对于WesternBlotWesternBlot和和ELISAELISA,最常用的二抗是酶标二抗;,最常用的二抗是酶标二抗;uu细胞或组织标记实验(细胞或组织标记实验(细胞免疫化学,组织免疫化学,流细胞免疫化学,组织免疫化学,流式细胞术式细胞术)中通常使用荧光基团标记的二抗,)中通常使用荧光基团标记的二抗,uu免疫组化免疫组化中也可以使用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶标记的中也可以使用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶
8、标记的二抗。二抗。uu如果想要更大程度的如果想要更大程度的放大检测放大检测信号,可以使用信号,可以使用Biotin/AvidinBiotin/Avidin检测系统。检测系统。uu在一些在一些荧光检测荧光检测方案中,则需要选择不同的荧光标记;方案中,则需要选择不同的荧光标记;uu金颗粒标记的二抗则更多的应用于金颗粒标记的二抗则更多的应用于免疫电镜免疫电镜中。中。n n4.是否经过血清吸附过的二抗为减少二抗与样本的非特异性结合,可选择经过血清吸附过的二抗如检测样本是人源的蛋白,一抗是小鼠源的单克隆抗体,二抗就需要选择抗小鼠源的二抗,如果对实验的特异性要求很高,选择经过人血清吸附过的抗小鼠源的二抗,
9、这种二抗由于经过人血清吸附而排除了与人源组织(如IgG等)可能发生非特异性反应的IgG,因此将非特异性结合降低到最低。n n5.二抗的类别亚型IgM是体液免疫应答首先产生的Ig。IgA是机体黏膜防御感染的重要因素。IgG是初级免疫应答中最持久、最重要的抗体,它仅以单体形式存在。大多抗菌性、抗毒性和抗病毒抗体属于IgGIgE是同速发型过敏反应发生有关的Ig。IgD以膜结合形式存在于B细胞,在B细胞分化发育中起重调节有作用n nIgM抗体的检测用于传染病的早期诊断中。间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体,因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体
10、,后者将竞争结合固相抗原而使一部份IgM抗体不能结合到固相上。因此如用抗人IgM作为二抗,间接测定IgM抗体,必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理,以除去IgG的干扰。n n免疫球蛋白在不同疾病的浓度高低 IgGIgGuu正常情况下正常情况下正常情况下正常情况下,脐血,脐血IgGIgG含量为含量为7.67.617g/L17g/L;血;血IgGIgG含量新生儿为含量新生儿为7.07.014.8g/L14.8g/L,0.50.56 6个月为个月为3 310.0g/L10.0g/L,6 6个月个月2 2岁为岁为5 512g/L12g/L,2 26 6岁为岁为5 513g/L13g/L,6 6121
11、2岁为岁为7 716.5g/L16.5g/L,12121616岁为岁为7 715.5g/L15.5g/L,成人为,成人为6 616g/L16g/L。uuIgGIgG增高增高增高增高:患慢性肝病、亚急性或慢性感染、结缔组织疾病、:患慢性肝病、亚急性或慢性感染、结缔组织疾病、IgGIgG骨髓瘤、无症状性单克隆骨髓瘤、无症状性单克隆IgGIgG病病等;等;uuIgGIgG降低降低降低降低:在遗传性或获得性抗体缺乏症、混合性免疫缺陷综合征、选择性:在遗传性或获得性抗体缺乏症、混合性免疫缺陷综合征、选择性IgGIgG缺乏症、蛋白丢失缺乏症、蛋白丢失性肠病、肾病综合症、强直性肌营养不良、免疫抑制剂治疗等情
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