植物基因工程下PPT课件.ppt
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1、第六章 植物基因工程(下)三、改进转基因的技术三、改进转基因的技术1.转基因植物中外源基因的沉默转基因植物中外源基因的沉默2.提高外源基因表达水平的策略提高外源基因表达水平的策略四、农作物基因工程四、农作物基因工程五、生物反应器五、生物反应器六、转基因植物的安全性六、转基因植物的安全性三、改进转基因的技术三、改进转基因的技术在在转转基基因因研研究究中中经经常常碰碰到到一一种种引引起起基基因因失失活活的的现现象称为象称为基因沉默基因沉默(gene silencinggene silencing)。)。基基因因沉沉默默可可以以发发生生在在染染色色体体DNADNA、转转录录和和转转录录后后3 3种不
2、同的层次上:种不同的层次上:1.1.发发生生在在染染色色体体DNADNA水水平平上上的的转转基基因因沉沉默默叫叫位位置置效应效应;2.2.发发生生在在RNARNA转转录录水水平平上上的的转转基基因因沉沉默默叫叫转转录录失失活活;3.3.发生在转录后水平的转基因沉默叫发生在转录后水平的转基因沉默叫共抑制共抑制。(一)转基因植物中外源基因的沉默(一)转基因植物中外源基因的沉默1.1.位置效应位置效应位位置置效效应应是是指指基基因因受受寄寄主主染染色色体体基基因因组组上上的的插插入入部位及周围核苷酸组成的影响。部位及周围核苷酸组成的影响。如如果果整整合合发发生生在在转转录录活活跃跃的的常常染染色色体
3、体上上,毗毗邻邻寄寄主基因的调控系列将影响到外源基因的表达;主基因的调控系列将影响到外源基因的表达;如如果果插插入入到到重重复复DNADNA或或异异染染色色体体中中或或旁旁边边,外外源源基因可能会失活。基因可能会失活。2.DNA2.DNA甲基化甲基化植植物物DNA DNA 甲甲基基化化程程度度是是较较高高的的,核核基基因因组组中中几几乎乎20%-30%20%-30%的胞嘧啶处于甲基化状态。的胞嘧啶处于甲基化状态。外外源源基基因因编编码码区区域域的的甲甲基基化化对对基基因因表表达达的的作作用用不不明显,通常检测不到对转录的影响;明显,通常检测不到对转录的影响;外外源源基基因因启启动动子子区区域域
4、或或5 5端端非非编编码码区区域域的的甲甲基基化化会会引引起起启启动动子子失失活活或或不不能能起起始始转转录录,在在转转录录水水平上诱导了外源基因的沉默。平上诱导了外源基因的沉默。3.3.重复序列诱发基因沉重复序列诱发基因沉默默通通过过电电击击法法等等将将DNADNA直直接接导导入入植植株株,外外源源基基因因往往往以多拷贝串联的方式整合在寄主的基因组内。往以多拷贝串联的方式整合在寄主的基因组内。重重复复序序列列诱诱发发的的基基因因沉沉默默(repeat repeat induced induced gene gene silencing,silencing,RIGSRIGS)与与重重复复序序列
5、列间间的的异异位位配配对和对和DNADNA的甲基化相关。的甲基化相关。一一般般一一个个位位点点插插入入的的外外源源基基因因的的拷拷贝贝数数越越多多,失失活的程度越高。活的程度越高。3.3.重复序列诱发基因沉重复序列诱发基因沉默默解决方案有:解决方案有:1.1.对对外外源源基基因因及及启启动动子子进进行行改改造造,保保证证设设计计的的序序列列与与植植物基因组有很短的同源序列,避免异位配对的发生;物基因组有很短的同源序列,避免异位配对的发生;2.2.使使用用基基因因枪枪法法及及电电击击法法等等直直接接DNADNA导导入入法法容容易易引引起起多多拷拷贝贝基基因因的的插插入入,而而使使用用农农杆杆菌菌
6、转转化化法法可可在在一一定定的的程程度度上避免多拷贝基因的插入;上避免多拷贝基因的插入;3.3.在在筛筛选选作作为为育育种种材材料料的的转转基基因因植植物物时时,尽尽量量选选择择单单拷拷贝贝插插入入的的个个体体,采采用用RT-PCRRT-PCR法法可可以以筛筛选选到到单单拷拷贝贝插插入入的的个体。个体。4.4.共抑共抑制制共共抑抑制制是是一一种种基基因因间间相相互互作作用用引引起起的的沉沉默默现现象象。当当引引入入一一个个与与植植物物内内源源基基因因有有部部分分同同源源性性的的DNA DNA 时时,不不但但外外源源基基因因不不能能高高效效表表达达,反反而而抑抑制制了了内内源基因的表达。源基因的
7、表达。二、提高外源基因表达水平的策略二、提高外源基因表达水平的策略1.1.转化方法的影转化方法的影响响基因直接转化法容易引起多拷贝转基因在寄主细基因直接转化法容易引起多拷贝转基因在寄主细胞中的整合,导致转基因沉默,而农杆菌介导的胞中的整合,导致转基因沉默,而农杆菌介导的遗传转化法由于产生的拷贝数相对较少,可以在遗传转化法由于产生的拷贝数相对较少,可以在一定的程度上避免这个问题。一定的程度上避免这个问题。2.2.使用信号肽使用信号肽植物蛋白质分子的定向运输需要特殊多肽信号的植物蛋白质分子的定向运输需要特殊多肽信号的引导作用。为提高转基因在植物的专门组织中的引导作用。为提高转基因在植物的专门组织中
8、的表达,除使用专门的启动子外,使用特定的信号表达,除使用专门的启动子外,使用特定的信号肽序列是必需的。肽序列是必需的。3.3.选择强启动子和诱导型启动选择强启动子和诱导型启动子子选择合适的植物启动子选择合适的植物启动子是增强外源基因表达的一个有效手是增强外源基因表达的一个有效手段。通常来源于双子叶植物的启动子,在双子叶植物中的段。通常来源于双子叶植物的启动子,在双子叶植物中的表达效率要比在单子叶植物中高得多,反之亦然。表达效率要比在单子叶植物中高得多,反之亦然。有时人们并不需要外源基因在受体植物中的高效表达,而有时人们并不需要外源基因在受体植物中的高效表达,而要求其能够在转基因植物中实现特异的
9、时空表达。这就需要求其能够在转基因植物中实现特异的时空表达。这就需要使用诱导型启动子,其在特定的条件下诱导在某些器官要使用诱导型启动子,其在特定的条件下诱导在某些器官组织中特异性地启动目的基因的表达。组织中特异性地启动目的基因的表达。4.4.强终止强终止子子在在植植物物转转化化的的研研究究中中,两两个个常常用用的的终终止止子子是是CaMV CaMV 35S35S启启动动子子和和根根瘤瘤土土壤壤杆杆菌菌T-DNAT-DNA的的胭胭脂脂氨氨基基酸酸合合成酶基因的成酶基因的nosnos终止子。终止子。其其PolyAPolyA尾尾巴巴和和其其中中的的茎茎-环环结结构构,可可有有效效地地抵抵御御核酸酶的
10、水解作用,使核酸酶的水解作用,使mRNA mRNA 分子保持稳定性。分子保持稳定性。5.5.消除甲基化的影响消除甲基化的影响已已知知用用5-5-氮氮胞胞嘧嘧啶啶处处理理植植株株具具有有很很好好的的抑抑制制甲甲基基化和脱甲基化作用。化和脱甲基化作用。人人们们还还试试图图在在载载体体上上加加上上去去甲甲基基化化功功能能的的序序列列来来防止甲基化。防止甲基化。6.6.使用植物偏爱的密码子使用植物偏爱的密码子转转基基因因的的密密码码子子和和植植物物基基因因组组DNADNA的的不不同同容容易易引引起起甲基化和表达效率低。甲基化和表达效率低。在在遗遗传传转转化化前前有有必必要要优优化化转转基基因因的的密密
11、码码子子,尽尽量量使用一些植物偏爱的密码子。使用一些植物偏爱的密码子。7.7.使用使用MARMAR序列序列基基质质结结合合区区(matrix matrix attachment attachment region,region,MARMAR)也也叫叫核核骨骨架架结结合合区区(scaffold scaffold attachment attachment region,region,SARSAR)长长度度一一般般为为300-1000bp300-1000bp,它它可可以以与与核核骨骨架架结结合合,在在两两个个MAR MAR 间间的的染染色色质质区区域域可可形形成成DNA DNA 环环,环环的的大大
12、小小为为5-200kb5-200kb,每每一一个个环环为为一一个个独独立的表达结构。立的表达结构。利利用用MAR MAR 的的这这一一特特性性,可可创创造造一一个个独独立立的的结结构构域域,减减少少了了插插入入位位点点附附近近染染色色质质的的影影响响,从从而而可可以以避避免免位位置置效效应应的的影影响响,还可以提高外源基因在转化细胞中的稳定性和表达水平。还可以提高外源基因在转化细胞中的稳定性和表达水平。8.8.使用增强子使用增强子动动物物免免疫疫球球蛋蛋白白K K链链基基因因的的增增强强子子可可在在细细胞胞发发育育的的特特定定阶阶段段指指导导该该基基因因区区段段的的去去甲甲基基化化,启启动动基
13、基因因的转录。的转录。在在植植物物中中分分离离相相应应的的增增强强子子,并并和和外外源源基基因因重重组组,可确保转基因按合适的调控模式表达。可确保转基因按合适的调控模式表达。9.9.外源基因的修饰和改外源基因的修饰和改造造(1 1)避免基因间的同源性;)避免基因间的同源性;(2 2)避免重复序列的出现;)避免重复序列的出现;(3 3)在载体上加增强翻译序列和核糖体结合位点。)在载体上加增强翻译序列和核糖体结合位点。(1 1)避免基因间的同源性)避免基因间的同源性重重复复或或同同源源序序列列是是基基因因沉沉默默的的诱诱因因,在在构构建建表表达达载载体体时时,应应尽尽量量降降低低所所设设计计的的序
14、序列列与与内内源源基基因因的的同同源源性性,以以减减少少或或避免配对避免配对。应应尽尽量量使使外外源源DNADNA碱碱基基组组成成与与植植物物DNADNA碱碱基基组组成成一一致致,避避免免被植物限制修饰机制所识别。被植物限制修饰机制所识别。也也可可采采用用定定点点插插入入方方法法,将将外外源源基基因因插插入入到到具具有有与与其其相相似似碱基组成的染色体区域。碱基组成的染色体区域。(2 2)避免重复序列的出现)避免重复序列的出现在在筛筛选选作作为为育育种种材材料料的的转转基基因因植植物物时时,应应尽尽量量选选择单拷贝插入的个体,来减少重复序列的存在。择单拷贝插入的个体,来减少重复序列的存在。TH
15、ANK YOUSUCCESS2024/3/12 周二21可编辑(3 3)在载体上加增强翻译序列和核糖体结合位点)在载体上加增强翻译序列和核糖体结合位点基基因因5 5端端和和3 3端端非非翻翻译译序序列列及及密密码码子子周周边边序序列列都影响到基因的高效表达。都影响到基因的高效表达。起起始始密密码码子子周周边边序序列列对对翻翻译译水水平平有有明明显显影影响响,通通常常植植物物起起始始密密码码子子周周边边序序列列有有如如下下特特征征:AACAAUGGCAACAAUGGC,起始甲硫氨酸后紧跟丙氨酸,起始甲硫氨酸后紧跟丙氨酸。10.10.以叶绿体作为转化受体以叶绿体作为转化受体叶叶绿绿体体的的基基因因
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