PCR引物设计及相关软件的应用--超实用.ppt
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1、PCR引物设计及相引物设计及相关软件使用关软件使用主要内容主要内容n n背景n nPCR引物设计原则n n常用PCR引物设计软件n nPrimer Premier 5.0 介绍n nOligo 6.22 介绍n n在线Primer3 介绍PCR聚合酶链反应聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)(Polymerase Chain Reaction,PCR)是是8080年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点;能在一个试管
2、内将所好、易自动化等突出优点;能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一要研究的目的基因或某一DNADNA片段于数小时内扩增片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断;可使肉眼能直接观察和判断;可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的量的DNADNA供分析研究和检测鉴定。供分析研究和检测鉴定。PCR引物设计引物设计n n引物设计是PCR 技术中至关重要的一环。使用不合适的PCR 引物容易导致实验失败:表现为扩增出目的带之外的多条带(如形成引物二聚体带),不出带或出带很弱,等等。现在PCR 引物设计大都通过计算机软件
3、进行。可以直接提交模板序列到特定网页,得到设计好的引物,也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。引物设计的原则引物设计的原则n n引物与模板的序列要紧密互补n n引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构n n引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。n n如引物长度(如引物长度(primer lengthprimer length),产物长度),产物长度(product lengthproduct length),序列),序列Tm Tm 值值(melting(melting temperature)temperature),引物与模板形成双链的内部稳定,引物与模板形成双链
4、的内部稳定性性(internal stability,(internal stability,用用 G G 值反映值反映),形成引,形成引物二聚体物二聚体(primer dimer)(primer dimer)及发夹结构(及发夹结构(duplex duplex formation and hairpinformation and hairpin)的能值,在错配位点)的能值,在错配位点(false priming sitefalse priming site)的引发效率,引物及产)的引发效率,引物及产物的物的GC GC 含量(含量(compositioncomposition),等等。必要时还)
5、,等等。必要时还需对引物进行修饰,如增加限制性内切酶位点,需对引物进行修饰,如增加限制性内切酶位点,引进突变等。引进突变等。具体因素具体因素一般原则一般原则n n引物的长度一般为引物的长度一般为15-30 bp15-30 bp,常用的是,常用的是18-24 bp18-24 bp,但不,但不应大于应大于3838。n n引物过短又同时会引起错配现象,一般来说引物长度大引物过短又同时会引起错配现象,一般来说引物长度大于于16bp16bp是必要的(不容易引起错配)。是必要的(不容易引起错配)。n n例如:一个长度为例如:一个长度为12bp12bp的引物在人类基因组上存在的引物在人类基因组上存在2002
6、00个个潜在的退火位点潜在的退火位点(3 x 10(3 x 109 9/4/41212=200).=200).而一个长度为而一个长度为20bp20bp的引的引物在人基因组上存在的退火位点只有物在人基因组上存在的退火位点只有1/4001/400个个.n n较长的引物(较长的引物(28-35bp)28-35bp)n n一般是用来区分同源性较高的模板序列或者使用于产生一般是用来区分同源性较高的模板序列或者使用于产生一些突变位点一些突变位点n nTm值的计算n n一般的公式n nTm=4(G+C)+2(A+T)n n对于长一些的引物可用更为准确的n nnearest-neighbor(Frier et
7、 al.(1986))一般原则一般原则2.引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3端相似性较高的序列,否则容易导致错配。引物3端出现3 个以上的连续碱基,如GGG 或CCC,也会使错误引发机率增加。一般原则一般原则3,引物3端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率,末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基,因此应当避免在引物的3端使用碱基A。另外,引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5端序列对PCR 影响不太大,因此常用来引进修饰位点或标记物。一般原则一般原则4.引物序列的GC 含量一般为40-60%,过高或过低都
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