二维电泳.doc

双向电泳技术对蛋白质样品的检测
姓名：### 学号：#### 专业：海洋生物学
同组实验者：### 指导老师：### 实验时间：2013.10.16-2013.10.18
一 实验目的
1.掌握双向电泳技术的实验原理。
2.运用双向电泳技术对蛋白样品进行检测。
3.通过实验，对双向电泳技术的应用领域以及实验注意事项进行讨论。
二 实验原理
双向电泳(Two-dimensional electrophoresis)是分析从细胞、组织或其他生物样品中提取出来的蛋白混合物最有力和广泛应用的方法。这项技术利用蛋白质在两次独立的分离步骤中的特性将蛋白质分开：包含有第一相的等点聚焦（Isoelectricfocusing,IEF）和第二相的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。
第一相的等电聚焦原理为：构成蛋白质的氨基酸同时含有羧基和氨基，为两性物质，有不同的等电点（pI）。pI=pH时，其静电荷为零，pH＞pI时，蛋白质带净负电荷，pH＜pI时，蛋白质带有净正电荷。蛋白质在pH梯度的条件下进行电泳，则特定的蛋白质在电场力作用下移动到自身等电点处便停止运动从而达到将不同的蛋白质分离的目的。
第二相聚丙烯酰胺凝胶电泳：SDS能够使蛋白质变性并和蛋白质结合使其带有大量的负电荷。和SDS结合的变性蛋白质在凝胶处的电场中迁移时，因为蛋白质分子量大小不同有不同的迁移率，从而达到根据分子量大小将蛋白质分离的目的。
双向电泳所得胶上的斑点都对应着样品中的一个蛋白质。因此，上千种蛋白质均能被分开，并且各种蛋白质的等电点、分子量和含量的信息都能够得到。双向电影技术作为生化分离技术具有其无可比拟的优点：对未处理样品耐受性好，无需纯化；分辨率非常高；可以对组分进行有效的收集；蛋白在凝胶介质中受到保护；在一次实验中可检测的蛋白更多；与后续分析技术兼容性好（如MDLC）；在蛋白质组学研究中应用范围最广。
双向电泳由于能同时分离上千种蛋白而得到广泛应用。在鉴定转录后和共转录修饰的能力方面双向电泳是独一无二的，这些修饰不能通过基因组序列预测。双向电泳的应用包括：蛋白质组分析、细胞差异性分析、疾病标志检测、治疗检测、药物开发、癌症研究、纯度检测和微量蛋白纯化。
三 实验步骤
1. 材料与试剂
1.1 材料
本实验所用样品为实验室指导老师提供的经一系列提取步骤所得的蛋白质样品，并用冰块覆盖临时保存保存。
1.2 试剂
1.2.1 1%溴酚蓝储备液：
溴酚蓝 100mg
Tris base 60mg
ddH2O To 10ml
1.2.2 1.5M Tris-Cl pH8.8(1000ml)：
Tris base 181.5g
ddH2O 750ml
HCl 调pH到8.8
ddH2O To 1000ml
1.2.3 平衡液：
1.5M Tris-Cl pH8.8 10.0ml
尿素 72.07g
Clycerol 69ml
SDS 4.0g
溴酚蓝（1%） 400µl
ddH2O To 1200ml
平衡液A：每10ml+0.1gDTT
平衡液B：每10ml+0.25gIAA
1.2.4 丙烯酰胺单体储备液：
丙烯酰胺 29.1g
N’,N-甲叉双丙烯酰胺 0.99g
定容到400ml,过滤，4℃保存。
1.2.5 电泳缓冲液（4*）：
Tris base 18.18g
Clycine 86.4g
SDS 6g
ddH2O 1.5L
1.2.6 10%SDS溶液：
SDS 5g
ddH2O To 50ml
过滤，室温保存。
1.2.7 分离胶配方：（300ml,13.5%）
单体储备液 135ml
10%SDS 3ml
1.5M Tris-Cl pH8.8 75ml
10%过硫酸铵 3ml
TEMED 0.12ml
ddH2O 90ml
1.2.8 琼脂糖封顶液
电泳缓冲液 100ml
琼脂糖 0.5g
溴酚蓝 200µl
微波炉中加热到琼脂糖完全溶解
1.2.9 染色液
考马斯亮蓝R-250 1g
甲醇/乙醇 450ml
冰醋酸 100ml
ddH2O 450ml
每块胶用250ml染色液染色1.5h。
2. 实验设备和仪器
离心管（0.5ml、1.5ml）、量筒（50ml、100ml、1000ml）、磁力搅拌器、移液枪（1000微升、200微升）、IPG固相胶条（pH4-7，17cm）、水化盘、镊子、聚焦盘、盐桥、灌胶板、垫片、电泳槽、电泳仪、保鲜膜、塑料抽提（20*30cm）、扫描仪、milliQ制水仪。
3. 实验操作
3.1 第一向等电聚焦
1. 从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液（1%溴酚蓝储液）（不含DTT)，置室温溶解。
2. 在0.5mlEP小管中加入精确称取的0.0015g DTT，加400µl水化上样缓冲液，加处理过的样品100µl，使其终体积为500µl，充分混匀。
3. 从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条（17cm pH 4-7），室温中放置10分钟。
4. 沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡，否则影响到胶条中蛋白质的分布。
5. 当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。加色拉油封闭。
6. 对好正、负极，盖上盖子，设置等电聚焦程序。胶条限制电压<50kV。
50V，8h(被动水化)；100V，1h；200V，1h；500V，1h；1000V，1h。逐步升压--聚焦（10万伏）--维持。
3.2 平衡
聚焦结束的胶条，立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，否则将胶条置于样品水化盘中，-20℃冰箱保存。
1. 配制胶条平衡缓冲液A、B。
2. 在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用去离子水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。
3. 将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，在有胶条的槽中加入5ml胶条平衡缓冲液A。将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。
4. 第一次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液A。并用滤纸吸取多余的平衡液。再加入胶条平衡缓冲液B，继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。
5. 将IPG胶条从样品水化盘中移出，用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸没在1×的电泳缓冲液中，然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上，用于第二向SDS-PAGE。
3.3 第二向SDS-PAGE
1. 配制10%的丙烯酰胺凝胶6块。配250ml凝胶溶液，每块凝胶40ml，将溶液分别注入玻璃板夹层中，上部留1cm的空间，用水饱和正丁醇封面，保持胶面平整。聚合30分钟。一般凝胶与上方液体分层后，表明凝胶已基本聚合。
2. 待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的水饱和正丁醇，去离子水冲洗。
3. 取出的以上处理过的胶条，用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面上，长玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着自己。
4. 将琼脂糖封胶液用微波炉进行加热溶解。
5. 将4×电泳缓冲液，用量筒稀释4倍，成1×电泳缓冲液。赶去缓冲液表面的气泡。
6. 将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上，短玻璃板一面对着自己。用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡。在用镊子、压舌板或平头针头推胶条时，要注意是推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到胶面。
7. 在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液封顶，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。
8. 已分装至200微升EP管中的Marker在100℃下活化5min，用适当大小的滤纸片完全吸取Marker，用吹风机吹干，置4℃冰箱中过夜待用。待低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后（约5min），用镊子或微量进样器将以上滤纸片推至与IPG胶平行的一端，将此凝胶转移至电泳槽中。
9. 在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用的低电流（5mA/gel/17cm）或低电压，待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流（或电压）（20-30mA/gel/17cm），待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。
19.电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号。
3.4 染色、脱色
1. 加入染色剂（考马斯亮蓝）染色过夜。
2.用水清洗凝胶，加入脱色液进行脱色。
3.5 观察结果
用扫描仪扫描凝胶，拍图分析。
四 实验结果与分析
1.双向电泳照片

2. 结果分析
从上面的图片看出，Marker并没有出现，而图上可见多个清晰的被染色的小点，这些不同的点就是不同的蛋白质，但点的数量并不多，部分有拖尾情况。鉴于此结果并不理想，无法用相关软件分析得到好的结果，故在此只做基于图片和实验操作方面的分析。
1. 配制母液或药品保存时间过长会严重影响实验的结果，如拖尾，或形成一片模糊；
2. 实验者的对本实验原理的掌握程度及操作的熟练程度会影响实验结果；
3. Marker没有跑出，可能与所配制凝胶的质量有关，从图中看出胶上缘的两边都呈圆角状，势必影响电泳结果；也可能蛋白试剂本身因存放时间过长或存放方法不对造成微生物污染。
4. 图中一些点不是很清晰，可能与染色时间、脱色时间及操作手法有关；点的数量不多，且集中分布，可能是蛋白样品制备步骤中的错误导致。
五 实验讨论
1. 蛋白质样品中的盐分、核酸、多糖等杂质应尽量除去；
2. 蛋白质样品中蛋白质浓度不宜过高，否则会造成蛋白质的聚集和沉淀；
3. 要始终注意IPG胶条的酸碱末端以及胶面，避免胶面接触物体被污染；
4. DTT有强还原性，在平衡中DTT应现配现用，防止被空气过度氧化；
5. 根据样中含有蛋白质的分子量大小，合理选择凝胶浓度；
6. 实验过程中的温度控制也是成功的关键因素之一。