PCR详细解PPT课件.ppt
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1、PCRPCR1.PCRPCR(Polymerase Chain Reaction)Polymerase Chain Reaction)技术即聚合酶链式反应,又称DNADNA体外扩增技术。19851985年由美国PE-CetusPE-Cetus公司的MullisMullis等人发明,荣获19931993年度诺贝尔化学奖。2.DNADNA半保留复制的机理;体外DNADNA分子于不同温度下可变性和复性的性质。PCRPCR的基本原理3.PCRPCR扩增体系模板(TemplateTemplate):基因组、质粒DNADNA、cDNAcDNA,也可以是细菌、组织样品等。引物(PrimerPrimer):确
2、定扩增目的序列的特异性;确定扩增产物长度。DNADNA聚合酶(DNA PolymeraseDNA Polymerase):推动PCRPCR反应进行的机器。扩增效率和保真性。缓冲液(BufferBuffer):控制体系的pHpH和离子强度,为DNADNA聚合酶提供最佳工作环境。脱氧核苷酸(dNTPdNTP):DNADNA的基本组成元件,包括dATPdATP、dGTP dGTP、dCTP dCTP、dTTP dTTP。MgMg2+2+、K K+、增强剂4.1.1.变性:高温使双链DNADNA解离形成单链(9595,30s30s)。2.2.退火:低温下,引物与模板DNADNA互补区结合(4545 6
3、565,30s30s)。3.3.延伸:中温延伸。DNADNA聚合酶催化以引物为起始点的DNADNA链延伸反应(7272,3030 60s 60s)。PCRPCR的基本原理5.6.7.高温变性8.低温退火9.中温延伸10.11.12.13.理论:2 2n n递增(n n为循环次数),如果扩增3030循环,目标DNADNA可增加2 23030也就是10109 9倍。实际:由于引物和底物的消耗,酶活力的下降等因素,扩增产物的增加,逐渐由指数形式变为线性形式,所以实际上进行3030个循环后,扩增倍数一般可达10106 6 10107 7。14.PCRPCR扩增曲线1.1.早期(E E期):引物在单链D
4、NADNA模板上搜索互补序列 ,并与特定位点杂交。2.2.中期(M M期):扩增反应顺利进行,产物呈指数型增长。3.3.晚期(L L期):平台期,DNADNA聚合酶过度损耗或者产物的抑制。15.PCRPCR扩增条件循环16.PCRPCR反应条件9494 5min5min9494 30s30s56.256.2 30s30s7272 30s30s7272 7min7min4 4 PC1-P20PC1-P20:模板:基因组DNADNA;产物:506bp506bp举个例子PCRPCR体系(10 L10 L)模板:1 L1 L上游引物:0.2 L0.2 L下游引物:0.2 L0.2 LEasy Taq
5、Easy Taq 酶:0.1 L0.1 LEasy Taq BufferEasy Taq Buffer:1 L1 LdNTPdNTP:0.8 L0.8 LddHddH2 2O O:6.7 L6.7 L3030个循环17.1.1.避免PCRPCR试剂的污染2.2.最适合的反应条件3.3.设置对照组:PCRPCR空白对照:在反应体系中剔除反应模板。PCRPCR阴性对照:即反应体系中用无关的基因片段代替目的模板。PCRPCR阳性对照:即反应体系中以已知能够成功进行特异性扩增的模板。PCRPCR的注意事项18.1.1.为什么完全没有PCRPCR扩增产物?试剂质量问题或者加样时出错,导致反应体系不完整。
6、聚合酶失活或反应体系中有聚合酶抑制剂。PCRPCR仪温度控制不精确。模板DNADNA发生降解。引物或反应温度设计不合理靶片段GCGC含量过高或扩增对象长常见问题19.2.2.为什么出现多条非特异性条带?反应体系被污染。引物特异性差。退火温度不合适。常见问题20.3.3.为什么PCRPCR产物很少?聚合酶活性过低。循环次数偏低。模板DNADNA浓度过低。常见问题21.4.4.为什么PCRPCR产物出现片状拖尾?DNADNA聚合酶过多或酶活性差。dNTPdNTP和MgMg2+2+浓度过高。退火温度过低,PCRPCR循环数偏多。模板DNADNA用量过大或模板DNADNA不纯。引物特异性差、引物间形成
7、二聚体导致非特异扩增。常见问题22.普通PCRPCR仪温度梯度PCRPCR仪23.实时荧光定量PCRPCR仪24.引物设计25.为了找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNADNA序列。引物是PCRPCR特异性反应的关键,同时也与PCRPCR扩增的效率密切相关。引物设计的最重要的原则:最大限度地提高扩增效率和特异性;同时尽可能减少非特异性扩增。引物设计的目的26.1 1、引物应具有足够的特异性。如果需要从基因组等较复杂的模板中扩增特定的DNADNA序列,则需要考虑目的DNADNA序列的保守性,尽量避免所选引物设计区域序列的非特异性。引物与非特异序列的同源性不超过70%70%或有连续8
8、 8个互补碱基。NCBI Primer BLASTNCBI Primer BLAST 引物设计的基本原则27.2 2、避开易形成二级结构的模板序列区域。分子内互补、发夹结构、分子间互补。二级结构会增加引物与模板杂交以及PCRPCR的困难,因此要尽可能避开这种序列区域。用有关软件预测mRNAmRNA的稳定二级结构。引物设计的基本原则28.29.3 3、引物长度一般为18-3018-30个碱基之间。引物长度与反应的特异性和解链温度成正相关。过短:扩增特异性下降过长:引物自身形成二级结构,以及引物二聚体。引物设计的基本原则30.4 4、G+CG+C含量一般为40%-60%40%-60%引物的碱基组成
9、也会对引物的解链温度产生影响。G+CG+C含量过低:引物解链温度低,引物易于从模板上解离。G+CG+C含量过高:引物解链温度高,易与非特异性序列杂交,出现非特异性扩增条带。引物设计的基本原则31.5 5、T Tm m值之差应小于1 1,最适退火温度在55-6055-60。一对引物的TmTm值差过大可直接导致PCRPCR扩增效率下降或失败。对于20bp20bp左右的引物:T Tm m()=2=2(A+TA+T)+4+4(G+CG+C)一般情况下,PCRPCR的最佳退火温度比引物T Tm m值低5 5左右。引物设计的基本原则32.6 6、引物中四种碱基最好是随机分布的 避免4 4个以上聚嘌呤或者聚
10、嘧啶的重复。特别是引物的33端不应有连续3 3个G G或C C,否则会使引物在G+CG+C富集序列区域产生错配,降低扩增的特异性。引物设计的基本原则33.7 7、引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物自身互补发夹结构 引物之间互补二聚体 引物自身连续互补碱基不应超过3 3个,引物之间连续互补碱基不应超过4 4个,尤其避免33端的互补重叠。引物设计的基本原则34.8 8、引物的55端可以修饰,33端不可以修饰。引物的55端决定着PCRPCR产物的长度,它对扩增特异性影响不大,可以被修饰而不影响扩增的特异性。如:加酶切位点、标记生物素、引入点突变等。由于延伸是从33端开始的,所以不能进行任何修饰
11、。引物设计的基本原则35.9 9、引物的33端不可以A A结尾。引物33端错配时,不同碱基引发效率存在着很大的差异,当末位的碱基为A A时,即使在错配的情况下,也能有引发链的合成,而当末位链为T T时,错配的引发效率大大降低,G G、C C错配的引发效率介于A A、T T之间,所以33端最好选择T T。引物设计的基本原则36.1010、引物33端要避开密码子的第3 3位。如扩增序列位于基因编码区域,引物33端不要终止于密码子的第3 3位,因密码子的第3 3位易发生简并,会影响扩增的特异性与效率。引物设计的基本原则37.1 1、避免重复碱基,尤其是G G。2 2、引物退火温度在58-6058-6
12、0之间。3 3、G+CG+C为30-80%30-80%。4 4、33端最后5 5个碱基内不能有多于2 2个的G G或C C。5 5、引物的产物大小一般在80-250bp80-250bp之间;80-150 bp80-150 bp最为合适(可以延长至300 bp300 bp)。Real-Time PCRReal-Time PCR引物设计原则38.6 6、要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。7 7、Real-Time PCRReal-Time PCR引物的扩增产物应跨外显子,最好是引物能跨外显子的接头区,以避免基因组DNADNA污染影响。Real-Time PCRReal-Time PCR
13、引物设计原则39.Primer Premier 5.0Primer Premier 5.0Oligo 6Oligo 6Primer 3Primer 3(在线)Primer-BLASTPrimer-BLAST(在线)引物设计常用软件40.File New DNA sequenceFile New DNA sequence粘贴模板序列41.42.引物搜索43.引物位置产物大小引物长度44.45.46.47.48.49.50.OligoOligo51.52.53.54.55.Primer BLASTPrimer BLAST56.57.58.59.60.逆转录PCRPCR61.由一条RNARNA单链转
14、录为互补DNADNA(cDNAcDNA)称作逆转录PCRPCR(Reverse Reverse Transcription PCRTranscription PCR,RT-PCRRT-PCR),由依赖RNARNA的DNADNA聚合酶(逆转录酶)来完成。逆转录PCRPCR的原理62.逆转录PCRPCR的原理63.逆转录PCRPCR的反应体系1 1、模板RNARNA2 2、逆转录酶3 3、逆转录引物64.65.66.67.93-9693-96,较高的温度变性更快更彻底,尤其是对富含G+CG+C的靶序列而言。68.退火温度与时间取决于引物的碱基组成、长度和浓度。退火温度可以通过计算推断,通常采用温度
15、梯度PCRPCR的方法进行摸索。45.0 45.5 46.9 49.0 51.4 53.8 56.2 58.6 60.9 63.1 64.5 65.0 MPC1-P20 PC1-P20 退火温度摸索69.延伸的温度通常为所以DNADNA聚合酶的最适工作温度,一般为7272;延伸的时间主要取决于目的片段的大小,不同种类的聚合酶的合成效率也不同,因此还与DNADNA聚合酶的种类有关。Easy Taq Easy Taq:1-2kb/min1-2kb/min TransStart Taq:1-2kb/min TransStart Taq:1-2kb/min FastPfu:2-4kb/min Fast
16、Pfu:2-4kb/min70.循环数:在其他参数都已优化的条件下,最适循环数取决于靶序列的初始浓度。一般情况下30-3530-35个循环即可。循环数太多:会增加非特异扩增产物的数量和复杂性。循环数太少:PCRPCR产量太低。71.逆转录引物:(1 1)随机六聚核苷酸引物 仅长6 6个核苷酸,每个核苷酸位点上随机加入4 4中不同的脱氧核苷酸,因此是4 46 6中不同引物的集合体。所有RNARNA分子均可以充当模板,合成的cDNAcDNA中有96%96%来自rRNArRNA。72.逆转录引物:(2 2)OligoOligo(dTdT)仅由dTTPdTTP构成,长度一般为18-18-2424个核苷
17、酸。识别mRNAmRNA的33端polypoly(A A)尾,因此仅mRNAmRNA可被逆转录。73.逆转录引物:(3 3)特异性引物 能与目标RNARNA碱基序列互补的寡核苷酸引物,仅产生待分析基因的cDNAcDNA。74.半定量 RT-PCR75.基本概念半 定 量 RT-PCR(semi-quantitatie reverse transcription and polymerase Chain reaction,SqRT-PCR)是常用的一种简捷、特异的定量RNA测定方法,通过mRNA反转录成cDNA,再进行PCR扩增,并测定PCR产物的数量,可以推测样品中特异mRNA的相对数量。定量
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