常用饲用酶制剂检测方法介绍.ppt
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1、几种酶制剂检测方法介绍几种酶制剂检测方法介绍饲料酶制剂饲料酶制剂 现市场上常见的饲料酶制剂多为复合酶,其现市场上常见的饲料酶制剂多为复合酶,其成分木聚糖酶、成分木聚糖酶、-淀粉酶、(酸性或中性)蛋白淀粉酶、(酸性或中性)蛋白酶、甘露聚糖酶、纤维素酶、酶、甘露聚糖酶、纤维素酶、-葡聚糖葡聚糖酶酶中的几中的几种。种。如何准确如何准确检测检测其中的一种其中的一种酶酶制制剂剂的活性?的活性?酶制剂检测原理酶制剂检测原理 酶与一般催化剂最主要的区别之一是它具有高度的专一性有高度的专一性。酶制剂检测原理酶制剂检测原理 样品检测:样品检测:酶制剂检测应用酶对底物专一性的特点,采用酶制剂检测应用酶对底物专一性
2、的特点,采用高纯度底物,专一检测某种酶制剂对底物的降高纯度底物,专一检测某种酶制剂对底物的降解,然后测定产物含量(分光光度计)。解,然后测定产物含量(分光光度计)。标准曲线:标准曲线:通过用其高纯度的产物制作标准曲线,通过分通过用其高纯度的产物制作标准曲线,通过分光光度计的读数查出对应的产物含量,然后计光光度计的读数查出对应的产物含量,然后计算酶活。算酶活。酶制剂检测原理酶制剂检测原理A.-淀粉酶淀粉酶 1.碘淀粉显色法 利用淀粉遇碘变蓝的反应,检测出未被淀粉酶利用淀粉遇碘变蓝的反应,检测出未被淀粉酶分解的淀粉,运用分光光度计测定碘反应蓝值的分解的淀粉,运用分光光度计测定碘反应蓝值的变化,然后
3、查表读取酶活。变化,然后查表读取酶活。特点:测定特点:测定-淀粉酶的碘淀粉显色法是专一性较高、操淀粉酶的碘淀粉显色法是专一性较高、操作较简便、准确性也较高的方法。作较简便、准确性也较高的方法。A.-淀粉酶淀粉酶 2.DNS显色法 原理:原理:淀粉淀粉酶酶水解淀粉生成的麦芽糖,将水解淀粉生成的麦芽糖,将3 3,55二硝基水二硝基水杨杨酸酸试剂还试剂还原生成原生成33氨基氨基55硝基硝基水水杨杨酸的酸的显显色基色基团团,在一定范,在一定范围围内其内其颜颜色的深色的深浅与糖的浅与糖的浓浓度成正比,故可求出麦芽糖的含量。度成正比,故可求出麦芽糖的含量。特点:专一性不高,易受其他淀粉酶(主要是特点:专一
4、性不高,易受其他淀粉酶(主要是-淀粉酶)淀粉酶)的干扰,因此,碘淀粉显色法应用较多。的干扰,因此,碘淀粉显色法应用较多。B.蛋白酶蛋白酶 1.1.FolinFolin法法 原理:蛋白酶水解酪蛋白,产生酪氨酸等酚基氨原理:蛋白酶水解酪蛋白,产生酪氨酸等酚基氨基酸,在碱性条件下,酚基氨基酸与基酸,在碱性条件下,酚基氨基酸与FolinFolin试剂反试剂反应生产蓝色物质,于应生产蓝色物质,于680680nmnm比色测定光吸收值,比色测定光吸收值,计算酶活力。计算酶活力。该法的准确性及灵敏度都较高,在国内已得到该法的准确性及灵敏度都较高,在国内已得到公认,是应用最广的方法,我国的部颁标准及各公认,是应
5、用最广的方法,我国的部颁标准及各大酶制剂生产企业都采用该法。大酶制剂生产企业都采用该法。B.蛋白酶蛋白酶 2.紫外分光光度法 原理:蛋白酶水解酪蛋白,产生酪氨酸等酚基氨原理:蛋白酶水解酪蛋白,产生酪氨酸等酚基氨基酸,利用酪氨酸基酸,利用酪氨酸在在280280nmnm处有特征性吸收峰处有特征性吸收峰,测测定计算酶活。定计算酶活。特点:紫外线操作比特点:紫外线操作比FolinFolin法简便,但灵敏度仅为法简便,但灵敏度仅为FolinFolin法的法的1/101/10。C.产还原糖酶制剂产还原糖酶制剂 现今采用的还原糖法通常是比色法,现今采用的还原糖法通常是比色法,黄色黄色的的3,5-3,5-二硝
6、基水二硝基水杨杨酸(酸(DNSDNS)试剂试剂与与还还原糖在原糖在碱性条件下共碱性条件下共热热后,自身被后,自身被还还原原为为棕棕红红色的色的3-3-氨基氨基-5-5-硝基水硝基水杨杨酸。酸。显色反应与不同聚合度显色反应与不同聚合度同源寡糖还原性末端的含量成正比同源寡糖还原性末端的含量成正比。特特点点:易易于于操操作作,价价格格低低廉廉,方方便便快快速速,重重复复性好性好 C.产还原糖酶制剂产还原糖酶制剂 能产生还原糖的酶有:包括能产生还原糖的酶有:包括纤维素酶纤维素酶、半纤维半纤维素酶素酶和和淀粉酶淀粉酶等。等。半纤维素酶是分解半纤维素半纤维素酶是分解半纤维素(包括各种降戊糖与包括各种降戊糖
7、与聚己糖聚己糖)的一类酶的总称的一类酶的总称,主要包括主要包括-葡聚糖酶、葡聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶半乳聚糖酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶。C.产还原糖酶制剂产还原糖酶制剂 1.还原糖法 2.粘度法 3.琼脂平板扩散法 4.可溶性的染色底物1.还原糖法还原糖法 还还原糖是指含有自由原糖是指含有自由醛醛基或基或酮酮基的糖基的糖类类,单单糖都是糖都是还还原糖原糖,双糖和多糖不一定是,双糖和多糖不一定是还还原糖,原糖,其中乳糖和麦芽糖是其中乳糖和麦芽糖是还还原糖,蔗糖和淀粉是原糖,蔗糖和淀粉是非非还还原糖。原糖。2.粘度法粘度法 原理:酶作用于具粘性的非淀粉多糖底物,使原理:酶作用于具粘性
8、的非淀粉多糖底物,使粘度下降,通过粘度计测定流速改变来计算酶粘度下降,通过粘度计测定流速改变来计算酶活力。该法灵敏度较高,可形象反映外切酶在活力。该法灵敏度较高,可形象反映外切酶在动物体内的作用方式,较适宜于饲用酶活性的动物体内的作用方式,较适宜于饲用酶活性的测定。测定。特点:特点:重复性差重复性差 ,费时、操作复杂、单位难以费时、操作复杂、单位难以换算成国际单位换算成国际单位 。3.琼脂平板扩散法琼脂平板扩散法 原理:将原理:将NSPS NSPS 底物与琼脂混融制成琼脂平板,底物与琼脂混融制成琼脂平板,将酶样点于琼脂板上的小孔中,培养一定时间,将酶样点于琼脂板上的小孔中,培养一定时间,选用能
9、与底物发生显色反应的显色剂染色,显选用能与底物发生显色反应的显色剂染色,显示出染色背景区和无色透明的水解区,水解区示出染色背景区和无色透明的水解区,水解区直径与酶量的对数呈正相关,由水解区直径计直径与酶量的对数呈正相关,由水解区直径计算酶活力。算酶活力。特点:灵敏度高,是还原糖法的特点:灵敏度高,是还原糖法的100100倍,测定所需样品倍,测定所需样品量微,无需特殊设备。量微,无需特殊设备。4.可溶性的染色底物可溶性的染色底物 原理:人工合成的含色原基团的底物在酶的作原理:人工合成的含色原基团的底物在酶的作用下释放出有色物质,利用分光光度计比色测用下释放出有色物质,利用分光光度计比色测定有色物
10、质含量,计算酶活力。定有色物质含量,计算酶活力。特点:特点:重复性好,操作简便,灵敏度较高重复性好,操作简便,灵敏度较高 ,但,但合成底合成底物与天然底物有区别,对结果的准确性可能有影响物与天然底物有区别,对结果的准确性可能有影响 ,并且底物昂贵。并且底物昂贵。D.脂肪酶脂肪酶 原理:脂肪酶在一定条件下原理:脂肪酶在一定条件下 ,能使甘油三酯,能使甘油三酯水解成脂肪酸、甘油二酯和甘油,所释放的水解成脂肪酸、甘油二酯和甘油,所释放的脂肪酸,可用标准碱溶液进行中和滴定,用脂肪酸,可用标准碱溶液进行中和滴定,用pHpH或酚酞指示反应终点,根据消耗的碱量,或酚酞指示反应终点,根据消耗的碱量,计算其酶活
11、。计算其酶活。反应式为:反应式为:RCOOH+NaOH RCOOH+NaOH RCOONa+H2O RCOONa+H2OE.植酸酶植酸酶 1.国标法(钒国标法(钒钼酸铵法)钼酸铵法)原理:利用植酸酶水解植酸钠产生无机磷,再原理:利用植酸酶水解植酸钠产生无机磷,再加入酸性钼钒试剂终止反应,同时与无机磷反应加入酸性钼钒试剂终止反应,同时与无机磷反应生成黄色钒钼磷络和物,在生成黄色钒钼磷络和物,在415415nmnm比色测定含比色测定含磷量,再以标准植酸酶为参照物,间接计算被测磷量,再以标准植酸酶为参照物,间接计算被测样品中植酸酶的含量。样品中植酸酶的含量。E.植酸酶植酸酶 2.硫酸亚铁硫酸亚铁钼蓝
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