一种高纯度多巴胺神经元原代培养方法的建立.pdf

!曼型!鲤2 二墨!兰墨绁胞皇公王丝痤堂盘查(垦b 也垦趔丛!型塑婪望竺1 2 至塑墨：丝(璺24 0 3论著文章编号：1 0 0 7 8 7 3 8(2 0 0 8)0 4 0 4 0 3 0 3一种高纯度多巴胺神经元原代培养方法的建立白龙梅1，李学忠1 一，张志琳1，刘春风1 2(苏州大学：1 附属第二医院神经内科，2 衰老与神经疾病实验室，江苏苏州2 1 5 0 0 4)摘要目的：通过胚胎中脑祖细胞(M P C)体外培养获得高纯度的多巴胺神经元培养体系。方法：取自E 1 2 鼠胚中脑腹侧的M P C 悬液在添加b F G F 的D M E w F l 2 N 2 I 广抗坏血酸一2 一磷酸酯倍半镁盐(从-2 P)培养液中扩增培养，5d 后停用b F G F，促进细胞分化，4d 后通过N e u r o b 鹊彬阿糖胞苷(A m-c)抑制胶质细胞生长，获得纯神经元，使用7 m 鉴定细胞，计数细胞比例和纯度，B-t u b u l i n I 鉴定成熟神经元，并计数细胞比例和纯度。结果：在添加了b F G F2 0 彬L 的D M E F 1 2 N 2 A A-2 P 培养液中M P C 增殖良好，体外培养7d 后细胞数量扩增到培养前的(1 6 5 4 1 2 5)倍；使用N e u-m b 船a L 阿糖胞苷后胶质细胞受抑制，神经元占9 4 以上，其中多巴胺(D A)能神经元的比例约(3 5 5 6 士4 1 3)。结论：E 1 2 鼠胚M P C 原代培养合并使用阿糖胞苷是获取高纯度D A能神经元培养体系的可靠途径。关键词 中脑前体细胞；多巴胺能神经元；细胞培养 中图分类号】R 3 9 2 1【文献标识码】A为探讨帕金森病的发病机制及治疗方法，常需在单细胞水平了解黑质多巴胺能神经元的生理生化特性及其对各种毒物、药物的反应。因此，高纯度、高质量、稳定地进行原代黑质多巴胺能神经元培养，是进行这一领域研究的关键技术。我们应用大鼠胚胎中脑祖细胞(m e s e n c e p h a l i cp m g e n i t o rc e s，M P C)体外培养技术，旨在能够获得较高纯度及较高质量的原代黑质多巴胺能神经元培养体系。1 材料和方法1 1 材料E 1 2S p 礓g L l e D a w l e y 孕鼠由苏州大学动物中心提供；D M E w F l 2 培养液、无血清培养添加剂N 2、胎牛血清(F B S)、2 5g L 胰酶消化液均购自G i b c o 公司；碱性成纤维生长因子(b 鹊i c 硒m b l 鹊t 鲫他f a c t o r，b F G F)、L-抗坏血酸一2-磷酸酯倍半镁盐(L a 8 c r o i da c i d 一2 一p h o s p h a t es e s q u i m a 印e 8 i 啪s a l t，从一2 P)、阿糖胞苷(眦b i n o s y l c y t 0 8 i n，A 姐一c)均购自s i 蛐公司；兔抗酪氨酸羟化酶(T H)单克隆抗体(m A b)购自N o v l l s 公司(编号3 0 0 1 0 9)；小鼠抗B T u b I d i n m A b 购自收稿日期：2 0 0 7 0 4 一1 9；接受日期：2 0 0 7 一0 9 1 2基金项目：江苏省“六大人才高峰”资助课题(卫生0 2 2)作者简介：白龙梅(1 9 8 0 一)，女，内蒙古鄂尔多斯人，硕士T b l：0 5 1 2 6 7 7 8 3 3 0 r 7；E-m a i l：H u c 亿O h o 劬a i l c 咖木C o m 8 p o n d i l l g t h o rc h e I I l i c o n 公司；免疫组化试剂盒购自B o s t e r 公司；抗小鼠c y 2免疫荧光染色试剂盒、抗兔c y 3 免疫荧光染色试剂盒和H 0 e c l l s t3 3 2 5 8 免疫荧光染色试剂盒均购自碧云天生物技术研究所。1 2 方法1 2 1细胞培养及绘制生长曲线M P C 的培养参照Y u等H 纠方法并适当修改，简述如下，E 1 2 孕鼠以乙醚麻醉后腹部消毒，剖腹取出子宫置于l Oc m 的消毒玻璃培养皿中；剪开子宫取出胚囊，用镊子撕破羊膜囊取出长约6 8m m(顶臀径)的胚胎，置入另一盛有D H a I l l【s 液的玻璃皿中；在解剖显微镜下切取中脑曲。切开中脑导水管腹侧，切取中央约0 5 姗0 6m mx 0 4 咖的中脑腹侧部分，置入约含0 5n l L取材液(2：1 的D M E 彬F 1 2、2g L 碳酸氢钠、2 0g LB 2 7、1 0g LN 2、0 2g LD N 鹅e)的1 5l l l L 的E P 管中，分别用lm L 和0 2m L 的枪头反复吹吸1 5 次；静置3l l l i n，去除沉淀，依胚胎数量加入1 5m L 培养液(2：1 的D M E M F 1 2、2 晷L 碳酸氢钠、2 0g LB 2 7、1 0g LN 2、l Om L LF B s、2 0 恤矿Lb F G F、1 0 0 斗m 彤LA A 一2 P)，玻璃移液管吹吸分散悬浮细胞。取l o 止细胞悬液加入1 0 灿4 L 台盼蓝溶液，充分混匀后倒置显微镜下计数并判定活细胞比例；调整细胞悬液密度至3 1 0 8 L，部分接种在预先用多聚赖氨酸包被的2 5c m 2 培养瓶中，每个培养瓶中加人3m L 细胞悬液。部分接种在用多聚赖氨酸包被的2 个2 4 孔培养板中，其中1 个2 4孔板放置用多聚赖氨酸包被的玻璃爬片，另一个不放，每孔中加入5 0 0 止细胞悬液，3 7、5 0m L Lc O：细胞培养箱中培养2 4h，细胞贴壁后吸除全部培养液，重新加入无血清培养液(2：1 的D M E M y F l 2、2g L 碳酸氢钠、1 0g LN 2、2 0 峙Lb F G F、1 0 0 斗m o L L 从2 P)继续培养，隔天更换半量培养液。细胞培养5d 后吸除全部培养液，换培养液(N e u r o b a s a l、2 0g LB 2 7、1 0m L LF B S、1 0 0 m 彬L 从一2 P、9g L 谷胺酰胺)，隔天更换半量培养液继续培养4d。接种在培养板中的细胞爬片在第5、7、9 天取出分别用于免疫组化、免疫荧光鉴定。接种在2 4 孔板中的细胞在第2、4、7、9 天接种分别随机取6 孔，加入2 5g L 胰酶消化，吹打成单细胞悬液，台盼蓝计数，计算平均每孔细胞数并记录，绘制原代培养细胞生长曲线。在培养瓶中细胞于第1 0 天换液，并加入终浓度为7 斗m o L L 的阿糖胞苷，培养2 天后吸除培养液后加人3m LD-H a I l l【s 液漂洗2 次后加入1 2 5g L 胰酶，倒置显微镜下观察细胞分散悬浮情况，约8 1 0I I l i n 后加人1 0 0m L LF B s 终止消化：继续用玻璃移液管吹吸分散细胞，细胞悬液收集人1 5r I l LE P 管中，4 下15 0 0r l l l i n 离心3I I l i n；弃去上清液，加入培养液(N e u r o b 嬲a l、2 0g LB 2 7、5 0m L LF B s、5 0m L L 万方数据!墨型!鲤!=墨!绁塑皇盆王鱼痤堂苤壶(g 堕垫g!堕竺!堡望!Q 12 兰塑墨：丝(业马血清、1 0 0 删LA A-2 P、9g L 谷胺酰胺)调整细胞悬液密度至2 1 0 8 L，在放置用多聚赖氨包被的玻璃爬片2 4 孔板中培养，隔天更换半量培养液，第3 天取含培养细胞的盖玻片经4 0g L 多聚甲醛固定后行免疫荧光染色。1 2 2 免疫荧光染色免疫荧光染色参照文献 3 的方法。简要操作步骤如下：细胞爬片或冰冻切片用P B S 冲洗5I n i n 3；加入3 7 预热的含4 0g L 多聚甲醛固定1 0I I l i n；P B s 漂洗3次，加入5 0 9 L B S A 和嘶t o n x 1 0 0 的0 O l m 彬L P B s，室温下置1h，加入抗孵育2h，一抗分别为兔抗T Hm A b(1：2 0 0 0)、小鼠抗B T I l i n m A b(1：l0 0 0)；P B s 漂洗3 次，加入二抗孵育1h，二抗分别为抗兔c y 3(1：3 0 0)、抗小鼠c y 2(1：3 0 0)；P B s 漂洗3 次后封片，荧光显微镜下观察、拍照片。免疫荧光双标结合H o e c h s t 衬染指的是在一抗孵育的过程中同时加入上述2 种一抗，浓度同前，孵育时间同前，并在二抗孵育后的P B s 漂洗后，加入1：l0 0 0 稀释的H o c e h s t3 3 2 5 8 孵育2m i n 复染细胞核，然后再继续P B S 漂洗3 次后封片。阴性对照用M P B s 代替特异性一抗，阳性对照采用雄性3 5 0g 左右的s p r a g l l e D a w l e y 大鼠的中脑黑质冰冻切片，其他步骤同上。荧光显微镜下观察并分类计数细胞。荧光显微镜使用铬滤片，c y 3 激发波长5 5 4 啪，发射波长5 7 0 咖；c y 2 激发波长4 9 5 砌，发射波长5 2 5n m；H o c e h s t3 3 2 5 8 激发波长3 5 4 砌，发射波长4 5 4n m。2 结果2 1E 1 2 鼠胚M P c 体外生长的形态学的观察体外培养第l 天培养细胞呈比较均匀的单个分散或数个聚集的贴壁生长，细胞周围有较强的折光性；4 8h 后即可形成集落状贴壁生长的细胞团；随着培养时间的延长细胞团直径进一步增大，3 4d 后可形成肉眼可见细胞团。4 5d 细胞团边缘可见大量长突起，少量细胞从细胞团内向外迁移，这些具有长突起的细胞形态相对成熟；6 7d 时当培养液中撤去b F G F 后，从神经球向外迁移的细胞明显增多，细胞形态进一步成熟(图1)。联合使用N e u r o b a s a l 和A m-c 后，细胞生长受到抑制，胞体呈多边形的胶质细胞皱缩，悬浮，换液后多为胞体椭圆的神经元细胞。2 2E 1 2 鼠胚M P C 细胞体外生长增殖能力的观察M P C 接种后部分细胞死亡，第2 天细胞数轻度下降，随后迅速升高，培养1 周后细胞数量达到培养前的(1 6 5 4 1 2 5)倍(乃=6)，随后增长速度放缓，9d 后，细胞数量为培养前的(2 1 3 5 2 0 3)倍。2 3E 1 2 鼠胚M P c 细胞体外培养后分化能力的观察及其鉴定细胞培养后的第2、6、1 0、1 2 天后，应用c y 3(红色)、c y 2(绿色)加H o e c h s t(蓝色)复染细胞核的免疫荧光标记技术定性观察培养细胞。结果显示，细胞培养的第2 天，T H 阳性细胞不明显，第6 天阳性细胞主要出现在细胞团块中，并且细胞突起明显。神经球内部以及神经球之间的多巴胺神经元形成广泛突触联系。T H 阳性神经元的比例与神经球的大小有关，神经球越大，阳性细胞的比例相对越高。第1 0 天，T H阳性神经元的数量继续增多，且有大量细胞开始向外迁移(图2)。在高倍视野下随机选取5 个视野，以H c l l s t 标记的细胞核数代表细胞总数，B-T u b u H n 阳性细胞数代表成熟神经元数，7 m 阳性细胞数代表多巴胺神经元数，取其5 个视野的平均数作为该爬片的实际细胞数，随机抽取5 个爬片。结果显示B-T u b l l l i n 阳性细胞占总细胞的(4 9 5 3 士2 3 4)，I H 阳性细胞占总细胞的(2 6 7 6 2 3 6)。第1 2 天，使用A m c 抑制胶质细胞生长后，神经元数量有所下降，但不明显，胶质细胞绝大多数消失，神经元比例达(9 4 7 3 2)，其中多巴胺神经元占总细胞数的(3 5 5 6 4 1 3)(图3)。图1 从神经球向外迁移的细胞(4 0 0)图2 免疫荧光(c y 3 标记一红色荧光)显示大量神经元从神经球中外迁(1 0 0)图3 免疫荧光双标结合H o e c l l s t 衬染的多巴胺神经元(4 0 0)3 讨论来自胚胎不同部位的神经前体细胞经体外培养后细胞分化有明显的区域特异性，来自中脑和间脑的神经前体细胞有更高的T H 抗原阳性细胞分化率，细胞形态也更接近于中脑D A 能神经元H 1。我们选择E 1 2 胎龄鼠胚作为实验对象，收集中脑腹侧细胞进行体外培养。b F G F 是促进有丝分裂的小蛋白分子或多肽类物质，具有促进神经元存活和生长发育作用。当b F G F 浓度达到1 0 2 0 斗g L 时，细胞增殖达较高水平，之后随着b F G F 浓度增加，细胞增殖速度反而下降。b F G F 有促进早期胚胎M P c 增殖的能力，b F G F 促进M P C 增殖有2 个高峰，第1 个高峰是神经元增殖高峰，出现在原代培养的前5d，6 9d 主要促进胶质细胞的增殖。抗坏血酸(A A)是人体生长和发育必需的营养素，最近研究表明其也有诱导中脑前体细胞分化为D A 能神经元的作用。k e 等”1 发现一定剂量的A A 单独也能诱导神经干细胞分化为D A能神经元。其机制可能是通过上调中脑前体细胞内E P o 和B M P 7 的表达来介导D A 能神经元的诱导分化。我们所用的A A 一2 P 是一种性状更加稳定的A A衍生物。在b F G F 和A A 一2 P 作用下，E 1 2 鼠胚中脑腹侧细胞体外培养4d 后能增殖形成肉眼可见的细胞簇，M P c 扩增培养7d 后，细胞数量大约增加到培养前的(1 6 5 4 1 2 5)倍，9d 后，细胞数量为培养前 万方数据!曼盟!Q 盟=墨Z 三!细照生筮王鱼蕉堂苤盔(垡地坠!塑壁!坐堡坚望Q!)塑墨：丝(垒)的(2 1 3 5 2 0 3)倍。1 0d 后培养细胞中T H 阳性细胞约占细胞总数的(2 6 7 6 2 3 6)。体外扩增培养第3 天开始细胞簇之间和细胞簇的边缘有一些贴壁生长、具有长突起的形态相对成熟的细胞，随时间延长呈逐渐增多的趋势；培养液中撤去b F G F 后，更多的细胞从细胞簇向外迁出、分化。考虑到N e u r o b a s a l 主要有利于神经元的生长、增殖，对胶质细胞生长起抑制作用，但不能促使胶质细胞凋亡。抑制细胞有丝分裂的药物A n c 可迅速作用分裂的神经胶质细胞，使之抑制或死亡，主要被胶质细胞摄取，引起胶质细胞凋亡，但也有部分被神经元摄取，导致神经元凋亡，且随时间和剂量呈正相关，因此我们在神经胶质细胞增殖的高峰期短期内加入A r a c。试验结果显示二者合用培养2d，细胞总数下降到原来的(5 4 6 5 3 3 8)，胶质细胞绝大多数消失，神经元比例达9 4 以上，其中多巴胺神经元占总细胞数的(3 5 5 6 4 1 3)。综上所述，我们认为E 1 2 鼠胚M P c 在包含有b F-G F 和A A 一2 P 的培养液中扩增良好，该培养液不仅能明显增加细胞数量，同时也能提高培养细胞向D A 能神经元的分化比例。联合使用N e u m b 鹊a l 和A r a-c 可4 0 5明显降低胶质细胞的含量，神经元的比例上升到9 4 以上，多巴胺神经元的比例更是达到了(3 5 5 6 4 1 3)，提示E 1 2 鼠胚M P C 原代培养，联合使用b F G F 和A A 2 P，合并使用A r a c 是建立高纯度D A能神经元培养体系可靠途径。参考文献：1 Y uD H，I 成K H，k eJ Y，e t 耐c h 粕g 髓0 fg e n ee x p 砖鹎i d t l r i I l gn e u 姗a ld i f f e 咖t i a 0 fc e n t r a ln e r v a u ss y s t 哪p】期m r 璐扛e a t e dw i t l la s c o r b i c i d J ，肫m i 肚，2 0 0 4，7 8(1)：2 9 3 7 2 z h a n g w，Q i n L Y，W 锄g T G，d 以3 一H y d r o 删h i n 叽i sn 啡p h i ct od 叩a l I l i n e 画cn e u r o a n di sa l n e u 舶恤D t t i v ea g a i n 8 tL P S i n d u c e dn e u m t 喇c 姊 J 脚_，2 0 0 5，1 9(4)：3 9 5 3 9 7 3 s a l t l l 岫-I 瑚s a l l eB，H i r 8 c hE c，w 池r tJ，耐耐R e u e0 fm e n 静p h a l i cd o p“n e r g i cn e 啪n si nc u l t u 咒b yk w l e v e ls t i m I l l a t i o no fv o l t a g e g a t e ds o d i 啪c h n e l s J _，胍谢，2 0 0 4，2 4(2 6)：5 9 2 2 5 9 3 0 4 H o r i g I l c h is，做a l l a s h iJ，I(i s h iY，钟以N e u r a lp r e 咄B 叫c e u sd e r i v e d 硒mh u m a ne m b r y o n i cb r a i n 弛t a i nr e g i 仰丑l 叩e c i i t y J ，M i 胝，2 0 0 4，7 5(6)：8 1 7 8 2 4 5 L J Y，K o hH c，c h 肌gM Y，甜羽E r y t h m p o i e t i n 明db o n em o r p h o-g e n e t i cp I D t e i n m e d i a l e 艄c o r b a t e i n d u c e dd 叩a n l i n e r g i c 删e”m i a t i o n台啪鲫b r)r 痂cm e n c e p h a J i cp r e c u 培懈 J 肫啪即们，2 0 0 3，1 4(1 0)：1 4 0 1 1 4 0 4，-l【|“_ _-_ l _”“-1 一r，l|I|1 一_|l l、_|1 r _ l|m I-_ _ -l|_ _ 一l-_ 一I【l 小(上接4 0 2 页)加入胸苷的时间，因生长活性好的V S M C，生长周期一般为2 0h 左右，一般要继续培养s+G，M 期时间(约为1 4h)；(4)同步V s M C，消耗时间长，采用F c M 密切监测其通过G。S 期、s 期进程，同时最终结果，需连续重复3 次以上实验一致才有一定的意义，而对于G：M 期，采用经S 期过后，1 0 0m m o L L 胎牛血清刺激后，流式细胞术监测同步效果一般在2 0 一3 0 左右(未列图)。而通过血清饥饿法后，采用秋水仙素1 0 0m L 刺激能达到5 0 以上的效果，根据实验结果，相对于细胞株来说，能够达到实验要求8|。V s M c 属于增殖潜能的细胞，其增殖过程受细胞周期的调控，生理状态下血管平滑肌细胞位于血管中层，处于静息状态，在细胞周期中停留在G。G。期，为可分化的、可收缩表型。而在某些情况下，血管中层的V S M C 就会被激活、开始D N A 复制，V s M c转化为合成表型。D N A 复制一旦被启动(G，s 期)，就会继续进入s 期、G：期和M 期，完成一个细胞周期。随着V s M c 细胞周期的运行，分泌大量细胞外基质，导致血管新生内膜形成及增生，因此V S M C 是再狭窄的主要作用细胞，也是再狭窄防治研究最重要的靶细胞。本实验中采用细胞周期的同步化，首次对于体外血管平滑肌培养，采用胸苷、秋水仙素同步，使细胞停留于G，S 期(D N A 合成起始转换点)、s、G：M 期(有丝分裂诱导转换点)。为进一步研究血管平滑肌细胞增殖调控机制提供依据。参考文献：1 o 而zF A，F u 8 t e rV P a t h 叩h y 8 i o l o g yo fc o r o n a r ya I t e r yd i s e a 8 e J C 矗n 哦咿肘以。1 9 9 6，1 2(1)：1 2 1 2 覃跃龙，舒茂琴，江明宏O R c l 基因R N A 干扰对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响 J 第三军医大学学报，2 0 0 6。2 8(1 1)：1 1 6 1 1 1 6 3 3 周永兰，陈清枝，张延斌，等雌激素对P D G F 诱导的血管平滑肌细胞增殖及细胞周期的影响 J 心脏杂志，2 0 0 6，1 8(6)：6 1 16 1 3 4 何丽洁，王汉民，杨贵清，等人肾小管上皮细胞血清饥饿法同步方法的研究 J 细胞与分子免疫学杂志，2 0 0 7，2 l(3)：2 7 5 2 7 6 5 袁勇，许顶立，刘伊丽，等血管平滑肌细胞增殖与c d l【抑制蛋白p 2 7 的表达 J 生理学报，1 9 9 9，5 l(3)：2 8 5 2 9 0 6 林菊生，冯作化现代细胞分子生物学技术【M 北京：科学出版社2 0 0 4：9 5 9 9 6 3 7 罗勇军，刘听，钱春荣P 1 T r GE s P l 在A 5 4 9s P c-A-A 细胞株sG 2 M 期的表达 J 第三军医大学学报，2 0 0 5，2 7(8)：7 l O 一7 1 2 8 P m t h e rR s，B o q u 既tA c，D a yB N c e uc y c l e 锄a l y s i so fc u l t u r e dp o r-c i n em 舯m a r yc e l l s J c z D n 打w，1 9 9 9，l(1)：1 7 2 4 万方数据一种高纯度多巴胺神经元原代培养方法的建立一种高纯度多巴胺神经元原代培养方法的建立作者：白龙梅，李学忠，张志琳，刘春风作者单位：白龙梅,张志琳(苏州大学附属第二医院神经内科,江苏,苏州,215004)，李学忠,刘春风(苏州大学附属第二医院神经内科,江苏,苏州,215004;苏州大学衰老与神经疾病实验室,江苏,苏州,215004)刊名：细胞与分子免疫学杂志英文刊名：CHINESE JOURNAL OF CELLULAR AND MOLECULAR IMMUNOLOGY年，卷(期)：2008,24(4)参考文献(5条)参考文献(5条)1.Horiguchi S;Takahashi J;Kishi Y Neural precursor cells derived from human embryonic brain retainregional specificity外文期刊 2004(06)2.Lee JY;Koh HC;Chang MY Erythropoietin and bone morphogenetic protein-mediate ascorbate-induceddopaminergic differentiation from embryonic mesencephalic precursors外文期刊 2003(10)3.Salthun-Lassalle B;Hirsch EC;Wolfart J Rescue of mesencephalic dopaminergic neurons in culture bylow-level stimulation of voltage-gated sodium channels外文期刊 2004(26)4.Zhang W;Qin LY;Wang TG 3-Hydroxymorphinan is neurotrophic to dopaminergic neurons and is alsoneuroprotective against LPS-induced neurotoxicity外文期刊 2005(04)5.Yu DH;Lee KH;Lee JY Changes of gene expression during neuronal differentiation of central nervoussystem precursors treated with ascorbic acid外文期刊 2004(01)本文读者也读过(10条)本文读者也读过(10条)1.陈立南.徐群渊.吕捷.张进禄.CHEN Li-nan.XU Qun-yuan.L(U)Jie.ZHANG Jin-lu 影响大鼠胚胎多巴胺能神经元原代培养因素的研究期刊论文-解剖学报2000,31(4)2.费力.江澄川.冯林音.季耀东 大鼠胚胎中脑前体细胞培养的研究期刊论文-中国临床神经科学2004,12(4)3.李卫贤.黄杰.周伟民.李家劲.魏璐城.赵海林 特重型颅脑损伤的院前急救和到院后处理会议论文-20044.沈礼芹.蒋金泉.郭建杰.魏璐城.赵海林 扩大翼点入路手术治疗对冲性侧裂区脑挫裂伤期刊论文-海南医学2009,20(11)5.刘明朝.陈景元.赵芳.李娟.毕媛.张云.骆文静.LIU Ming-chao.CHEN Jing-yuan.ZHAO Fang.LI Juan.BI Yuan.ZHANG Yun.LUO Wen-jing 高效的多巴胺能神经元原代培养方法及其影响因素的研究期刊论文-现代生物医学进展2006,6(12)6.李卫贤.魏璐城.赵海林.LI Wei-xian.WEI Lu-cheng.ZHAO Hai-lin 枕额对冲伤的临床特点和治疗措施期刊论文-中华神经医学杂志2005,4(3)7.李卫贤.魏璐域.李志强.郭建杰.赵海林 重型颅脑损伤急性弥漫性脑肿胀的临床特点和治疗措施会议论文-20078.陈锋.李卫贤.冯华民.张少川.王元军.赵海林.CHEN Feng.LI Wei-xian.FENG Hua-min.ZHANG Shao-chuan.WANGYuan-jun.ZHAO Hai-lin 超早期手术联合川芎嗪治疗高血压脑出血32例期刊论文-中国基层医药2010,17(2)9.李卫贤.魏璐城.邝英桥.郭建杰.赵海林.LI Wei-xian.WEI Lu-cheng.KUANG Ying-qiao.GUO Jian-jie.ZHAOHai-lin 重型颅脑损伤脑疝的救治与预后期刊论文-中国基层医药2006,13(1)10.李学礼.吕立夏.徐磊.杨翠香.姚劲松.王尧 活性依赖性神经保护蛋白同源基因在帕金森病模型鼠脑中的表达期刊论文-中华老年医学杂志2003,22(10)本文链接：http:/