衣原体病病原的分离与鉴定_李树根.pdf

衣原体病病原的分离与鉴定李树根综述刘福安审校衣原体病(Chlamydio sis)为鹦鹉衣原体(ehza。;yd玄aps云才亡ae)引起 的禽类、哺乳类、节足类及其他动物的疾病的统称。鹦鹉热由M6ra-n群氏于189 5首先倡用的。后来发现其他非鹦鹉科禽类(包括家禽和野禽)一也能 感 染 本病,遥Meye:氏(194 1)遂提出鸟疫(Ornithosis)这个名词。现已知鹦鹉热和鸟疫只有流行病学方面的差异,并没有本质上 的区别,近些年来,统称为衣原体病。衣原体可 引起鹦鹉、鸽、鸡和其它禽类的隐性或慢性感染。鸽子隐性感染较多,因地区不同可达2 Q5 0%。在美国的火鸡群、在欧洲鸭群中传染性最大。迄今已发现10 0 种以上的不同鸟类受到自然感 染。此病广泛分布于五大洲。现将国外关于衣原体病的禽 病原体分离与鉴定方法概述如下。衣原体的分离(一)病料的采取和保存1.急性传染的病料采集:急性的、严重感 染的衣原体病动物,在剖检时,可采集病变器官的分泌物或有充血的组织、充血的肺组织、有病变的脾和肝的组织块、增厚的有分泌物被复的气囊膜或分泌液、充血部位的肠粘膜或结肠的内容物、结膜或鼻的分泌物,活体病料可采集 结膜刮落物,用棉试子沽取气管和鼻分泌物,在发热期取全血并用肝素作抗凝处理,及采取粪便。2.隐性或亚临床感染的病料采集:温和病例或亚临床感 染的禽进行尸体剖检时,应采集这 些禽的肝、脾、肾和结肠内容物等病料作病原的分离。呈隐性感染的禽脾或肝可能会肿大,或气囊增厚。肠道的亚临感染床是常见的,其病原体可以从新鲜的粪便中分离到(Page,198 0)3.病料标本的保存:采集的标本必须避免接 触对衣原体或细胞有 害的物质(甘油对衣原体有灭活的作用)。常用的保 存液为蔗糖、磷酸盐、谷氨酸盐培养液。另外,任何组织培养的维持液如31 0%小牛血清、培养 肉汤、脱脂奶 等,加入抗菌素(链霉素5 0一1 00微克/毫升,万古霉素5 0一10 0微克Z毫升,弗来霉素3 0微克/毫升)都可以用来保存 标 本。在一2 0或更低的温度下,组织标本中的衣原体可长期维持其括力,保存的温度不要在。一一2,之 间反复波动。在严重感染的组织内,衣原休可在4中保 持 活力动天。但在 这期间.传染的效价二引斩地下降到零(Page,1980)(二)分离方法1.病料标本的处理:爪无 菌 操旅采茱的标本加六到营养肉汤或PES(PH了.2)中研磨 戊 2 040%怒液,4放置4小时,取上清掖接种污染的标本,每毫升可加入链霉素、万古霉素、卡那霉素1毫克,或庆大霉素。.1一。.5毫克处理2小时。如 采集的标本严重污染 时,必须在匀浆液中加入链霉素(1 0 毫克/毫升)和新霉 素(1毫克/毫升)或链霉素(5毫克/毫升),短湘素(。.。2毫克厂 毫升)和磺胺嚓咤(2毫克/毫升)或杆菌肤(10 00单位/毫升)(Seha eht。r等,1 978)。液体的标本如肝素处理血 液和无菌操作采集的腹水,可直接接种实验动物分离衣原体。粪便和细菌污染严重的组织标本,悬浮在2 0%的链霉素、万古霉素和卡那雷素溶液中,1000转分钟离心三次,每次3 0分钟。每次离心后,提取上清液的中间部分作为下次离心液,而其它任何漂动的材料或沉淀物废弃。第三次离心后,提取中间层溶液作为接种用(Sto rz,19 71)。所有磨碎和匀浆化的操作穆序必须是无菌的,在安全罩下操 作目的是防止 细菌污染和消除气溶胶感 染操 作人员的危险。2。首选的实脸动物和培养物:实验动物可用 鸡胚、小 鼠和豚鼠、更普遍采用的是传代细胞系培养物,特别是MeC6y细胞(Scha Chter等19 78)。3。小白鼠、豚鼠的接种:取处理过的标本。5毫升,接 种于三周龄小白鼠腹腔中(也可 同时接种0.伪毫升于脑内),每份标本接种6一6只,观察2 1天。所有的衣原休各毒株都能在实验小白鼠中分离繁殖,感染衣原体的小日鼠在5 1 5天内死亡。毒性强的 衣原体将会产生 严 重 的全身性感染,5一7夭 后可能发生死亡。剖检可见器官充血,特别是肺部,脾和肝肿胀,以及在腹膜和胸腔有粘稠的渗出物。一层纤维蛋白膜可能复盖和围绕肝和脾,具有特征性 的是所有渗出物 都含有大量 的单核细胞,其中许多细胞的胞浆内有衣原体存在(Page,198。)。如果致病力较弱的衣原体,小白鼠不一定死亡。但是,衣原体可在腹膜的细胞内增殖和生长而损坏血管的内皮,并从腹膜的毛细血管 中渗出浆液,在一 只六周龄的小白鼠腹腔内这种液体可增加到加毫升,因而,引起幼鼠肿胀而不能活动。这 些液体中的 单核细胞通常是严重地感染了衣原体的(Page,198 0)。鹦鹉衣原体 的强毒致死株一也同样能够在豚鼠中分离到,豚 鼠的接种反应与小白鼠相似。但致病力 较弱的毒株不能引起豚鼠病 变。用 豚鼠代替小自鼠作诊断时,其优越性在于感染 衣原体前后较容易抽血作血清学检验。因此,有感染衣原体的病例,就可用血清学方法加以证实(Page,295 0)。选择接种试验用的小白鼠和豚鼠有可能已自然地感染了衣原体。据Pag。介绍,许多实 验室 的小白鼠群的肺已分离到至少6株鹦鹉 衣原体和沙眼衣原体的Nigg s的“鼠性肺炎”株。因此,选择接种试验用 的小白鼠时,必须确证该鼠是没有存在衣原体感染的动物。4.鸡胚卵黄囊接种:Page最近 的;报导,认为在鸡胚中大部分衣原体生长最适温度是3 9%,当于3 9 4 1孵化感染鸡胚时,鸡胚致死的平均天数都减少13天。接种的鸡胚每天检查,共观察两周左 右,最初三日内死亡的弃去,接种三日后死亡的鸡胚 最好在频死前收 获卵黄囊,作徐片,用Gimeno z氏法染色。传代时,先 把鸡胚放4冰箱预冷数小时,再收获卵黄囊,制备成5 0%卵黄囊悬 液。每胚接种。.2毫升,共接种3一6个。盲传三代无生 长者,判为阴性。阳性的指征 为:在卵黄囊涂片 内找到原生小体;连续传代的鸡胚死亡;用2 0一5 0%感染卵黄囊悬液在沸水 中加热一小 时,制成抗原,与高效价抗血清进行补体结合试验,证明卵黄囊中存在着组抗原,无菌检验阴性。5。细胞培养物接种:从 禽类中获得的衣原体株在鸡胚原代细胞上或来源 于小白 鼠(“L”细胞、McCoy细胞)的细胞培养物上 生长 良好(Page,1,8。)。为了天然感染组织中的衣原体的早期繁殖,组织培养比鸡胚卵黄囊更易感。例如将衣原体 悬 液2 00。转/分钟离心艺6 0分钟后,直接接种于单层 细 胞上,宿主 细胞 的感染量就能够大大地增加。在3 7培养时,衣原体在宿主细胞的生长期一般历时1 7一48小时(Page,1950)。衣原体的鉴定(一)镜检衣原体能够在新鲜的渗出掖或感染组织印片中用显微镜检查出来。姬姆萨氏和Gimonez氏方法 是根据这些病原体的不同生长期着色不同。姬姆萨氏染色后,在油镜下可看到上皮细胞内有衣 原体包涵体。这2些包涵体是由红色或紫色的原生小体颗 粒 组成的块质,以及 由兰色到紫色较大 的始 体组成。Gimene z或Ma。h 认Ve ll o氏染色时,可见原生小体 染 成红色,底色呈兰绿色。处于早期发育阶段的衣原体的包涵体,用Gimone z氏染色效果不佳;用卵黄 囊和胎盘印片或在感染了衣原体的细胞培养物中,在其发育周期的后期,用二G宜二。n。对氏染 色会得到 良好的效果(Pag:,2950)(二)生长特性衣原体仅仅在宿主细胞的胞浆内通过多 阶段的发育环节而增殖。通过显微镜下检查,可发现在许多宿主 细胞的胞质内有大小不同的原生小体颗粒组成的块质(Sehaehfe r等,1盯8,Sto rz,2 97工;Moulde r,19 67)所有的衣原体株(除了人为的突变株外)的生长都受四环素、氯霉 素和5一氟尿嚓陡所抑制,大部分的毒株对青霉素和环丝氨酸敏感。所有的沙眼衣原体株对磺胺嘀吮钠敏感,但任何一株沙眼衣原体株和鹅鹉衣 原体株在鸡胚的生长都不受浓度为1毫悦/毫升的硫酸链霉素、硫酸卡那霉素、万古霉素、杆菌肚和短杆菌素的影响(Pag。,19 8。)(三)血清学鉴定常用于鉴定衣原体杭原的血清学方法有:1.补体结合试验:Gri二e s和Pag。(29 75)用去氧胆酸盐抽提衣原体抗原,用改良的直接补体结合试验(MDCF)测定 禽血清中的 衣 原体抗 体,比用A GP方法敏感。但有些鸟类血清不能结合豚鼠的补体。因此,应当进 行间接补 体 结合试验(1CF)。停血清则可以作直接补体结合试验(DCF)。感染的禽和哺乳动物的CF抗体通常7一1 0 天出现。慢性感染的禽和鸽子 一般可产生很 高的抗体滴度。肠道感染的动物,抗体效价是低的。在一畜禽群中,血清学阳性无症状出现的个体,鸽子可达8 0%,麻雀0一5 0%,绵羊20一50%,牛2。一100%,火鸡5 07 0%(Pa g。,1 980)。就个体来说,衣原体病 的血、.学诊断需要 杭体滴度最少升高四倍的证据。然而,从群体来说,如果群 内有8 0%或更多的个体有抗体 滴度,.其中有一半在1:6 4以上,这就表明这个群体正在流行衣原体病(Page,1980)。当病原 体在 鸡胚 卵黄囊 内增殖 后,收获卵黄囊,制备抗原,用相应的抗血清作补体结合试验滴定。如果卵黄囊抗原1:8稀释,气囊和 心包膜制备的CF抗原1:3 2稀_释能结合补体,而 阴性对照血清不结合补体,则证明抗原中有衣原体存在(Page,1980)2.免疫萤光抗体试验:比较常用 的是间按染色法(IF A)。亲一血清是用感染鸡胚卵黄囊免 疫家免制成的。第二血清是羊抗兔球蛋白萤光抗体。一般用超声诊断在兽医上的应用陈白希译刘福安校引言在已见到 的兽医诊断方法的许多进展 中,超声显象技术是最有成效的一部份:这些方法的优点在于它是非侵入 性的、无害的和显然是安全的,而且基本上是可携带的。缺点是当超声应用于骨骼和含 气 构造(即肺和肠)这样的组织时遇到困难。虽然这些技术大都 尚未 渗入到开业的兽医界中,而它在医学界中的使用随着新用途的发现正以飞快的速度推广开来。本文对超声装置 的基本原理、市售的仪器类型及其在兽医方面的应用进行了叙述。超声的原理据说发现压 电效 应的原理一即某种晶体物质固有的特性一是Cur r沁兄弟的功劳。使 晶体产生机械上的一二丁二二之二之众一之一二二二:一七之之又或二一之之一1:2。以上的稀释液。阳性标本片的细胞浆内包涵体可呈现明亮 萤光块质(Ardrey等,19 72,Euge st“r等,19 7 0,Tes sler等,1 97 9,Page,197叹)。最近的试验研究表明,用IFA法来检出受感染 的细胞培养物和各种禽以及哺乳动物的组织切片或涂片中的衣原体抗原是可靠的(Page,198 0)。3.琼脂凝胶沉淀(AGP)试验:本试验的敏感性比CF试验稍差些。但是,作为大量的血清学样品调查,流行病学群体的定性诊断,病原 的分离鉴定试验,仍是一种切实可行的方法(Page,1974,Grimes等,1978)。4。其它的血清学方法:衣原体的某些特异抗原能够结合某些特定的毒素。因此,通过对毒素的中和反应,可以对衣原体作分类。由于鸟疫一类的衣原 体不易产生 中和抗体,所以,极少用作为细胞培 养物的血清中和试验。有些衣原体还具有对鸡与小白鼠红细胞的血凝时,血 凝作用可用同种抗体抑制。(四)衣原体的毒价测定衣原体的毒价测定常常是以6一8日龄的鸡胚以卵黄囊途径和细胞培养物进行接 种,测定鸡胚的半数致死量(ELD50)或测定璧半数组织培养 感 染量(TCID50)。变形,则 引起一种电压的产生,而以电压对其激励又导致机械上的变形。这 种晶体是很重要的,因为它可作为 叫做声波仪的所有超声仪器的声头。声波仪(不管其特殊用途怎样),都有一个装有压电效应晶片的手持换能器,当电振荡时 晶片发出一种称为超声的高频声波(兆周/秒)。这种高频 声波穿过与换 能器邻接的组织,而且每当声束遇到一种组织界面时(例如肾脏、肾囊 脂肪)则反射回来(回声)。这种返回的声波(回声)为换能器自动检测并经电子学处理,转换为声波仪显示屏上的图象。高频超声通过软组织传播,就象一种速度大约为1500米/秒的笔形光束那样。在它遇到的不同组织的界面处,这种高频声束则被吸收、反射或折射。只有反射并返回到换能器 上的声波才 能显”现 图象。图象的分辨力(可见度)与晶体的振荡频率成正比,例如一个2兆赫晶片可分辨大约相距1毫米的图象。声束的穿透力与它的频率成反比,因此,高频晶J二二奋、沁 习户叼户“、于、二矛、户、沪 产、产产产 产主要参考文献1.Pag e,L.Aficat注onof Avian1980。2.Grimes,丁.奋aals olatio nthoge ns”,&Ident主-4 3一4 8。E.,etal.,A丫ianDis.Vol。22(8)连22一430.3。Sehaehte r,o ratoryDiagn osis1 97 8。,etal,Chap1 1,Lab-Chlamydialinfect-J.玩ionsPP18 122 0。19 78。Page,L。A。:17thAn nualPr oe。A 皿、As so e.Vet.Lab。Diagnostieian s。5 1一62,1974。5。Res。33:6。Ardr ey.,W.B.etal.,Am.J.Vet.25 35一2 53 819 72。Storz,J.,aC hlamvdiaandChla皿-ydia一Indue edDis eases.,2971.7。noll、8。Med.43:Eugester,A.K.,etal.2*35 1359。19 70。Tes sler,J。etal.,Can.工nf&Im皿让-ComP。217222。1979。