T_GDPMAA 0012-2023 高通量基因测序项目分类.pdf
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1、高通量基因测序项目分类The Classification Criteria of High Through-put Gene Sequencing Projects(发布稿)(本稿完成时间:2023-6-7)T/GDPMAA 00122023广 东 省 精 准 医 学 应 用 学 会 团 体 标 准T/GDPMAA442023-7-22 发布ICS 01.040.11C 302023-7-22 实施广东省精准医学应用学会发布T/GDPMAA 00122023广东省精准医学应用学会(GDPMAA)是广东省组织开展精准医学学术交流、国际交流、人才培养、出版刊物、科技创新、产学研相结合等活动的省级
2、社会团体。制定广东省精准医学应用学会标准(以下简称:粤精准医标准),满足企业需要,推动企业标准化工作,是广东省精准医学应用学会的工作内容之一。中国境内的团体和个人,均可提出制、修订粤精准医标准的建议并参与有关工作。粤精准医标准按广东省精准医学应用学会团体标准管理办法(试行)进行制定和管理。粤精准医标准草案经向社会公开征求意见,并得到参加审定会议的75%以上的专家、成员的投票赞同,方可作为粤精准医标准予以发布。考虑到本标准中的某些条款可能涉及专利权,广东省精准医学应用学会不负责对任何该类专利权的鉴别。在本标准实施过程中,如发现需要修改或补充之处,请将意见和有关资料寄给广东省精准医学应用学会,以便
3、修订时参考。该标准为广东省精准医学应用学会制定,其版权为广东省精准医学应用学会所有。除了用于国家法律或事先得到广东省精准医学应用学会文字上的许可外,不许以任何形式再复制该标准。广东省精准医学应用学会地址:广东省广州市越秀区天河路 45-21 号邮政编码:510075 电话:020-87001157 传真:020-87001157网址:电子信箱:T/GDPMAA 00122023I目次前言.II引言.III1 范围.12 规范性引用文件.13 术语和定义.14 缩略词.35 高通量基因测序项目的综述.36 高通量基因测序项目分类.46.1 核酸提取项目及其分类.46.2 样本采集项目及其分类.5
4、6.3 测序项目及其分类.57 高通量基因测序检测项目的技术分类.77.1 样本准备.77.2 测序文库构建.77.3 测序.87.4 数据分析.97.5 结果报告和咨询.97.6 质量控制.108 高通量基因测序在肿瘤领域的应用分类.108.1 DNA 测序.108.2 RNA 测序.139 高通量基因测序在遗传领域中的应用分类.139.1 组织 DNA 测序.139.2 单细胞 DNA 测序.159.3 细胞外游离 DNA 测序.1610 高通量基因测序在感染与微生物领域的应用分类.1710.1 病原宏基因组下一代测序.1710.2 病原靶向下一代测序.1911 高通量基因测序在临床其它领
5、域的应用.1911.1 药物基因组学的临床检测.1911.2 移植配型.2011.3 白血病的诊断.20参 考 文 献.21T/GDPMAA 00122023II前言本标准按GB/T 1.1-2020给出的规则起草。本标准由广东省精准医学应用学会提出并归口。本标准起草单位:中山大学孙逸仙纪念医院、中山大学附属第一医院、中山大学附属第三医院、南方医科大学珠江医院、南方医科大学南方医院、广东省人民医院、广州医科大学附属第一医院、广州医科大学附属第二医院、暨南大学附属第一医院、广东省中医院、广东省公共卫生研究院、因美纳(中国)科学器材有限公司、北京泛生子基因科技有限公司、北京贝瑞和康生物技术有限公司
6、、深圳华大基因股份有限公司、广州达安基因股份有限公司。本标准主要起草人:欧阳能太、廖健伟、杨剑锋、章钧、周宏伟、柯尊富、侯铁英、郑磊、刘世霆、黄宪章、刘艳辉、陆元志、蔡贞、林勇平、熊丽、张凤玲、赵智贤、蒋析文、陈定强、莫立乾、李淑华、段朝晖、周强、姜萍萍、钟晶、曾凡薇、栗东芳、殷晓燕、李沛志、梁蕊、罗镇明、马山、梁志坤、周建文、石永杰、何群、张婉君。本标准是首次制订。T/GDPMAA 00122023III引言随着精准医学的发展,作为精准医学领域核心技术的高通量基因测序(又称二代测序、下一代测序、NGS)技术近些年来逐渐兴起,已越来越广泛地应用于临床实践,特别是在肿瘤个体化治疗、遗传性疾病、感
7、染性疾病和药物基因组学等多个领域已取得了长足的进步。高通量基因测序的平台、技术、产品,也得到了长足发展,呈纷繁复杂之势。但对于高通量测序的项目分类,目前还没有统一标准。高通量基因测序项目分类的缺失,不利于政府监管部门对这一新技术进行的分类监管,不利于推进技术规范应用;不利对于高通量检测进行分类的成本核算,不利于定价机制的合理形成;不利于研发企业部署产品研发线路,研发新技术、新产品。因此,为了推进、规范和促进高通量基因测序技术应用,我们亟需规范对高通量基因测序检测项目在临床应用上的分类,并明确有关类别,从而推动相关技术的价格形成机制研究,明确相关项目的定价逻辑和定价参考标准,为行业内的应用方、研
8、发方等提供清晰的指引,助力提升医疗保障水平。T/GDPMAA 001220231高通量基因测序项目分类1范围本标准规定了高通量基因测序检测项目在临床应用中的分类原则和分类类别。本标准适用于规范高通量基因测序检测在临床应用中的分类,指导有关高通量基因测序检测在临床应用中的研发、定价和推广。本标准适用于临床医学领域中涉及高通量基因测序项目研发和应用的医疗卫生机构、第三方检测机构、技术研发企业等。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 29859-2013 生
9、物信息学术语GB/T 34798-2017 核酸数据库序列格式规范GB/T 35890-2018 高通量测序数据序列格式规范GB/T 30989-2014 高通量基因测序技术规程T/GDPMAA 0004-2020 基于孕妇外周血浆游离DNA高通量测序无创产前筛查胎儿基因组病技术标准3术语和定义3.1高通量测序(High-throughput sequencing)也称为下一代测序技术(next-generation sequencing,NGS),指通过大规模平行测序等技术对包括人类外显子或者全基因组序列等进行测序,同时产生数千条至数百万条测序片段,然后通过生物信息处理与标准参考基因组序列比
10、对等,得到序列变异、融合、拷贝数变异(copy number variants,CNV)等信息。3.2全基因组测序(Whole genome sequencing,WGS)对人类基因组的全序列进行测序,包含基因外显子区域与非编码区域。3.3外显子组测序(Whole exome sequencing,WES)指针对人类基因组全部蛋白质编码区域(外显子组)的基因集进行高通量测序。目前,全外显子测序已应用于单基因遗传病疾病、复杂罕见病、肿瘤用药指导等。3.4靶向测序(Targeted sequencing/Target region sequencing)指针对某一类疾病(或表型)已知的致病基因及关
11、联基因或已知的驱动基因或抑癌基因或已知的致病性病原微生物基因或耐药基因对应的序列进行高通量测序检测。靶向测序包含除全基因组测序外的其他目标区域测序。T/GDPMAA 0012202323.5实体瘤靶向测序(Targeted sequencing of solid tumor)3.5.1 肿瘤大 panel 测序(Large solid tumor gene panel)指实体瘤相关的驱动基因或抑癌基因,重要信号通路基因对应的序列进行高通量测序检测,该检测同时需要满足肿瘤突变负荷(Tumor mutation burden,TMB)检测要求:检测范围包含 300 个以上基因且检测 panel 编
12、码区域大于等于 1.0Mb。3.5.2 中 panel 测序(Medium solid tumor gene panel)指检测范围在 100-300 个实体瘤相关的驱动基因或抑癌基因,重要信号通路基因对应的序列进行高通量测序检测。3.5.3 小 panel 测序(Small solid tumor gene panel)指检测范围在100 个实体瘤相关的驱动基因或抑癌基因对应的序列进行高通量测序检测。3.5.4 肿瘤循环 DNA 测序(Circulating tumor DNA sequencing)通过高通量测序技术针对血液中游离的肿瘤 DNA 片段进行测序,获取肿瘤的相关基因组信息。ct
13、DNA 测序技术可以应用于肿瘤的早期诊断,肿瘤精准用药指导,耐药机制评估以及预后评估和复发监测。3.6无创产前筛查(Non-invasive prenatal testing,NIPT)针对胎儿 21、18、13 三体综合征,通过母血浆中胎儿游离 DNA 片段进行高通量测序检测。3.7基因组拷贝数变异测序(Copy number variation sequencing,CNV-Seq)基于高通量测序的低深度全基因组测序,针对不同样本来源(如羊水、绒毛、脐带血、流产组织、外周血等)进行染色体拷贝数变异检测。3.8胚胎植入前非整倍体检测(Preimplantation genetic testi
14、ng for aneuploidies,PGT-A)指在接受辅助生殖技术治疗的患者中,对胚胎滋养层细胞进行活检获取细胞利用高通量测序技术针对胚胎细胞进行染色体非整倍体检测,选择性植入正常胚胎,避免因异常胚胎造成的反复种植失败、反复流产、出生缺陷等。3.9胚胎植入前染色体结构异常检测(Preimplantation genetic testing for structural chromosomalrearrangements,PGT-SR)指在接受辅助生殖技术治疗的患者中,对胚胎滋养层细胞进行活检获取细胞利用高通量测序技术针对胚胎细胞进行染色体结构异常进行检测。针对夫妻双方之一为染色体结构异常
15、携带者。3.10植入前单基因遗传病检测(Preimplantation genetic testing for monogenic disorders,PGT-M)指在胚胎移植前,对胚胎滋养层细胞进行活检获取细胞,利用高通量测序技术针对胚胎细胞进行单基因遗传疾病的基因变异进行检测,降低单基因病出生缺陷风险。3.11宏基因组高通量测序(Metagenomic nextgeneration sequencing,mNGS)指通过对临床样本中微生物和宿主核酸的测序分析,无偏倚地检测多种病原微生物。3.12测序深度(Sequencing depth)指在一次测序实验中对特定基因组区域或整个基因组的测序
16、覆盖度。通常以倍为单位来表示,如100表示该基因组区域或整个基因组的碱基被测序 100 次。T/GDPMAA 0012202333.12.1 平均测序深度(Mean depth)指针对所检测区域测序所得的碱基总数除以该区域的长度。3.12.2 有效平均测序深度指去重后的平均测序深度。3.13体细胞变异(Somatic variant)指肿瘤细胞中发生的基因组变异,是后天发生的,而不是遗传所得。3.14胚系变异(Germline variant)指存在于生殖细胞中的基因组变异,这种变异会遗传给后代。与体细胞变异不同,胚系变异发生在胚胎发育过程中,或者在父母的生殖细胞中。4缩略词cfDNA游离脱氧
17、核糖核酸(Cell free deoxyribonucleic acid)ctDNA肿瘤循环脱氧核糖核酸(Circulating tumor deoxyribonucleic acid)CNV拷贝数变异(Copy number variation)cPAS联合探针锚定聚合(Combinatorial probe-anchor synthesis)CV变异系数(Coefficient of variation)MSI微卫星不稳定性(Micro-satellite instability)NGS下一代测序(Next generation sequencing)PCR聚合酶链式反应(Polymera
18、se chain reaction)QC质量控制(Quality control)SBS边合成边测序(Sequence by synthesis)TMB肿瘤突变负荷(Tumor mutation burden)WES外显子组测序(Whole exome sequencing)WGS全基因组测序(Whole genome sequencing)mNGS靶向宏基因组测序(Metagenomic next generation sequencing)tNGS靶向下一代测序(Target next generation sequencing)5高通量基因测序项目的综述自从人类基因组计划完成,以下一代基
19、因测序(next generation sequencing,NGS)或二代测序、高通量基因测序为代表的新型技术不断涌现,基于基因解码的精准医学在短期内得到了蓬勃发展。NGS项目可从临床应用、技术原理及样本类型等方面进行分类(图 1)。其中,NGS 项目的临床应用主要包括以下几方面:(1)肿瘤:1.目的为靶向用药的检测,项目有实体瘤的几个基因、几十个基因到几百个基因的 panel,变异类型包括单碱基变异、小插入/缺失、大片段缺失/重复、拷贝数变异等,几百个基因的大 panel 还要求能报告肿瘤突变负荷(tumor mutation burden,TMB),测序深度通常设置为 1000左右。另外
20、,在组织不可及时也可以采用外周血检测 ctDNA,需要提升测序深度至 5000左右;2.目的为肿瘤预后与诊断的检测,这方面比较复杂,通常采用中到大的 panel;3.目的为治疗后复发监测的检测,主要是ctDNA-MRD 检测,需要超高测序深度,如几万至十万乘。(2)遗传与代谢:1.儿童遗传或代谢疾病的基因诊断,主要是胚系的基因检测,目前较常用的项目有中小 panel 基因、医学全外显子组(约 4 千多基因)和全外显子组(2 万多基因)检测,测序深度通常为 100左右;2.无创产前筛查(noninvasive prenatal testing,NIPT),通过母亲外周血检测胎儿染色T/GDPMA
21、A 001220234体非整倍体,主要是 21-三体、18-三体和 13-三体,是通过对全基因组层面超低深度测序而计算获得;3.产前全外显子组检测,与儿童遗传全外相同,但因胎儿表型很难提取而致解读困难,适用范围需严格控制;4.生殖领域胚胎植入前的遗传基因筛查与诊断。(3)病原微生物:临床最主要的应用项目是宏基因组测序和病原微生物靶向测序,包括 DNA 和RNA 病原微生物,可不需要培养,直接从样本中提取核酸进行测序鉴定,在临床应用具有很大的优势。但由于很多样本中含有大量的人类基因组和定植菌,在结果解读时经验很重要。(4)其它领域:包括药物基因组学、白血病和移植配型等领域也已开始应用 NGS 技
22、术进行更加全面的基因谱检测以指导临床诊疗。图 1 高通量基因测序项目分类原理示意图6高通量基因测序项目分类高通量基因测序项目的各环节中,因应样本的差异、检测目标的差异,实际上在核酸提取、样本收集、生信及病理分析等步骤中存在较大差异,鉴于此,本标准将核酸提取、样本收集等环节单独作为高通量基因测序的大类项目先行划分,再对测序环节及分析环节进行项目分类归纳。6.1核酸提取项目及其分类按照待提取核酸类型的不同,其提取工艺、技术、成本等将存在差异,建议分类如下:T/GDPMAA 001220235表 1 核酸提取项目分类表类型提取工艺备注DNADNA 的提取制备-RNARNA 的提取制备逆转录的步骤以及
23、对 RNA 酶的预防其它特殊类型核酸宏基因组、表观修饰的 DNA 或 RNA、tRNA、或通过指定技术手段获得的基因组片段(如三维基因组等)提取工艺的复杂程度须依据具体检测对象而定对于核酸提取项目的收费标准,建议按上述项目差异进行分类区分,依据对应的核酸提取工艺的成本核算情况进行计算。6.2样本采集项目及其分类按照待处理的样本类型,其采集工艺、技术、成本等将存在差异,建议分类如下:表 2 样本采集项目分类表类型来源采集及处理方式胚系细胞外周血白细胞、口腔上皮细胞等抽血、口腔取样、毛发采集等组织细胞特定组织,包括正常组织和病变组织手术、抽血等游离核酸外周血中的细胞外游离核酸抽血或取腔隙体液+靶向
24、富集宏基因组目标组织中的微生物菌群-对于样本采集项目的收费标准,建议按上述项目差异进行分类区分,依据对应的样本采集及处理工艺的成本核算情况进行计算。6.3测序项目及其分类鉴于测序过程中,其检测范围与建库工艺相关联,其数据量、测序深度与测序通量对应的芯片规格相关联,同时其分析难度与具体分析要求相关联,因此我们建议,按测序的范围差异、数据量差异、数据分析要求差异等范畴进行分类。对于测序环节的项目收费标准,建议按上述项目差异进行分类区分,X1/X2/Y/Z 代表不同分类要求的收费单价,依据对应的测序参数、工艺、分析需求等的成本核算情况进行计算。其中,全基因组测序范围最广,位点最多,宜按次为基准进行价
25、格核算,靶向测序宜以位点进行价格核算;同时,根据数据量和测序深度的差异,宜按测序通量为基准进行价格核算;另外,人工数据分析方面包括质控、数据处理、病理分析等环节,宜在对应人力资源成本基础上按工时核算。项目分类结果详见以下表格。T/GDPMAA 001220236表 3 高通量基因测序项目分类表项目名称应用领域具体项目按测 序范 围差异(建库工艺差异)按数据量/测序深度差异(通量差异)按数 据分 析要求差 异(含质控、序列数据处理、样本病理评估)全基 因组 低数据量二代测序染色 体非 整倍体、拷贝数变异筛查、拷贝数变异检测、病原微生物 宏基 因检测,进行病原微生物鉴定NIPT、PGT-A、NIP
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