WS_T 594-2018 蝇类抗药性检测方法 家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶等位基因检测法.pdf
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1、ICS 11.020 C 05 WS 中华人民共和国中华人民共和国卫生行业卫生行业标准标准 WS/T 5942018 蝇类抗药性检测方法 家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶等位基因检测法 Test methods of fly resistance to insecticides-A molecular method for detecting insensitive ace allele in the Musca domestica 2018-03-01 发布 2018-08-01 实施 中国人民共和国国家卫生和计划生育委员会发布中国人民共和国国家卫生和计划生育委员会发布 WS/T 5942018 I
2、前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准主要起草单位:中国科学院动物研究所、北京市疾病预防控制中心、扬州大学、中国疾病预防控制中心传染病预防控制所、中国农业大学、中国人民解放军军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所、上海市疾病预防控制中心。本标准主要起草人:邱星辉、李梅、曾晓芃、钱坤、周小洁、李静、刘起勇、高希武、赵彤言、冷培恩。WS/T 5942018 1 蝇类抗药性检测方法 家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶等位基因检测法 1 范围 本标准规定了家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶等位基因的检测方法。本标准适用于家蝇乙酰胆碱酯酶第342氨基酸位点基因型的检测。2 术语和定义 下列术语和定
3、义适用于本文件。2.1 乙酰胆碱酯酶 acetyl cholinesterase 存在于生物体的一种水解酶,由乙酰胆碱酯酶基因ace编码。2.2 等位基因 allele 存在于同一物种的相同基因的不同形式互称为等位基因。2.3 342G、342V 和 342A 342G、342V和342A分别表示家蝇乙酰胆碱酯酶第342氨基酸残基位点上的氨基酸为甘氨酸(Gly)、缬氨酸(Val)和丙氨酸(Ala)。3 样本采集 采用诱捕或网捕等方法从现场采集家蝇成虫内,浸泡在100%乙醇溶液中带回实验室。浸泡样品可在4 条件下短期(6个月内)保存,可在-20 以下长期保存。4 引物 引物F的序列为CGGTGC
4、ATTTGGGTTTCTAC,引物R的序列为 CGTAACCGCTAAGATCTGCTG。引物设计参照附录A。配制为10 mol/L浓度,保存于-20 冰柜。5 仪器设备 5.1 PCR(聚合酶链式反应)仪。5.2 琼脂糖凝胶电泳仪。WS/T 5942018 2 5.3 凝胶成像仪。5.4 恒温水浴锅。6 主要试剂 6.1 DNA聚合酶(Taq酶)。6.2 限制性内切酶Bsp1286I。6.3 限制性内切酶Eae I。7 操作步骤 7.1 在 PCR 管中加入 10PCR 缓冲液(含 100 mmol/L Tris-HCl,500 mmol/L KCl,15 mmol/L MgCl2)2.5
5、L,dNTP(2.5 mmol/L)2.0 L,引物 F 0.5 L,引物 R 0.5 L,单头家蝇的基因组 DNA 1 L (100 ng300 ng,提取方法可参见附录 B,也可用商售的 DNA 提取试剂盒或其他类似方法提取)和 Taq酶(25 个单位),用灭菌水补齐至 25 L,混匀。7.2 将 PCR 管放入 PCR 仪中,设置 PCR 反应程序为:94 3 min;94 30 s,50 30 s,72 30 s,35 个循环;72 10 min。运行程序。7.3 PCR 运行结束后,取 5 L PCR 产物在 1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳,电压设定在 160 V,电泳20 min
6、后在紫外光下检测,有清楚单一的 609bp 的条带的 PCR 产物用于进行以下酶切反应。7.4 取合格样品(即电泳检测产物为 609bp)的 PCR 产物设置两个酶切反应,反应 A 用 Bsp1286I 酶、反应 B 用 Eae I 酶进行酶切,酶切反应体系的设置根据酶产品的使用说明进行(参见附录 C)。7.5 将酶切后的产物上样在 1.5%的琼脂糖凝胶上,电压设定在 160 V,电泳 20 min 后在紫外光下检测。8 基因型确定基因型确定 根据酶切产物的电泳结果(参见附录 D),确定家蝇个体的乙酰胆碱酯酶的基因型,见表 1。表1 家蝇个体乙酰胆碱酯酶的基因型确定 反应 I(加 Bsp128
7、6I 酶切)反应 II(加 Eae I 酶切)乙酰胆碱酯酶 342 氨基酸位点基因型 361bp、248bp 609bp 敏感型纯合子(G/G)609bp 609bp 不敏感 I 型纯合子(V/V)609bp 361bp、248bp 不敏感 II 型纯合子(A/A)609bp、361bp、248bp 609bp 不敏感 I 型/敏感型杂合子(G/V)609bp、361bp、248bp 609bp、361bp、248bp 不敏感 II 型/敏感型杂合子(G/A)609bp 609bp、361bp、248bp 不敏感 I 型/不敏感 II 型杂合子(V/A)注:G 表示氨基酸残基为 Gly(甘氨酸
8、);V 表示氨基酸残基为 Val(缬氨酸);A 表示氨基酸残基为 Aal(丙氨酸)。WS/T 5942018 3 A A 附 录 A(资料性附录)引物设计参照序列 342V CGGTGCATTTGGGTTTCTACATCTTTCACCGGTTATGCCAGGTTTTGAAGAAGAAGCTCC 342A CGGTGCATTTGGGTTTCTACATCTTTCACCGGTTATGCCAGGTTTTGAAGAAGAAGCTCC 342G CGGTGCATTTGGGTTTCTACATCTTTCACCGGTTATGCCAGGTTTTGAAGAAGAAGCTCC 342V CGGCAACGTGGGTCT
9、TTGGGATCAGGCCTTGGCCTTGCGTTGGCTGAAGGAGAATGCCCG 342A CGGCAACGTGGGCCTCTGGGATCAGGCCTTGGCCTTGCGTTGGCTTAAGGAGAATGCCCG 342G CGGCAACGTGGGCCTTTGGGATCAGGCCTTGGCCTTGCGTTGGCTGAAGGAGAATGCCCG 342V TGCATTTGGCGGCAATCCGGAATGGATGACGCTGTTTGGTGAATCGGCTGGTTCGAGTTC 342A TGCATTTGGCGGCAATCCGGAATGGATGACGCTGTTTGGTGAATCGGCTGG
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