学术讨论—第三章细胞破碎.ppt
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1、第三章第三章 细胞细胞(xbo)破碎破碎第一页,共九十一页。生物生物(shngw)分离过程的一般流程分离过程的一般流程第二页,共九十一页。不同不同(b tn)类型的细胞分泌目标产物的类型类型的细胞分泌目标产物的类型n动物细胞:大多无细胞壁,其培养动物细胞:大多无细胞壁,其培养(piyng)产物大多分产物大多分泌在培养泌在培养(piyng)液中。液中。n植物细胞:多为植物细胞:多为胞内胞内产物。产物。n微生物:大多数小分子代谢产物分泌在微生物:大多数小分子代谢产物分泌在胞外胞外;大多数大分;大多数大分子产物和基因重组产物为子产物和基因重组产物为胞内胞内产物,如胰岛素、干扰素、产物,如胰岛素、干扰
2、素、白细胞介素白细胞介素-2等均为胞内产物。等均为胞内产物。n对于胞内产物,首先必须将细胞破碎,使产物得以释对于胞内产物,首先必须将细胞破碎,使产物得以释放,才能进一步提取。放,才能进一步提取。第三页,共九十一页。主要主要(zhyo)内容内容n3.1 细胞壁的组成与结构细胞壁的组成与结构n3.2 细胞破碎技术细胞破碎技术(jsh)的分类的分类n3.3 常用破碎技术常用破碎技术n3.4 破碎技术的发展方向破碎技术的发展方向n3.5 破碎率的测定破碎率的测定第四页,共九十一页。3.1 细胞壁的组成细胞壁的组成(z chn)与结构与结构n微生物细胞的外围通常包括微生物细胞的外围通常包括细胞壁细胞壁和
3、和细胞膜细胞膜。n细胞壁(外壁):具有固定细胞外形和保护细胞免细胞壁(外壁):具有固定细胞外形和保护细胞免受机械损伤的功能;受机械损伤的功能;n细胞膜(内壁):具有高度选择性的半透膜,控制细胞膜(内壁):具有高度选择性的半透膜,控制(kngzh)胞内外一些物质的交换渗透作用。胞内外一些物质的交换渗透作用。细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁。细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁。第五页,共九十一页。细菌细菌(xjn)的细胞壁的细胞壁n几乎所有细菌的细胞壁都是由坚固骨架几乎所有细菌的细胞壁都是由坚固骨架肽聚糖肽聚糖组成。组成。nG+细胞壁结构与细胞壁结构与G-有很大不同。有很大不同。n破破碎碎细细菌菌的的主
4、主要要阻阻力力是是来来自自(li z)于于肽肽聚聚糖糖的的网网状状结结构构,其其网网结结构构的的致致密密程程度度和和强强度度取取决决于于肽肽聚聚糖糖上上所所存存在在的的肽肽键键的的数数量量和和其其交交联联的的程程度度,如如果果交交联联程程度度大大,则网结构就致密。则网结构就致密。第六页,共九十一页。第七页,共九十一页。酵母菌的细胞壁酵母菌的细胞壁主主要要成成分分:葡葡聚聚糖糖与与甘甘露露聚聚糖糖以以及及蛋蛋白白质质等等,比比革革兰兰氏氏阳阳性性菌菌稍稍厚厚,面面包包酵酵母母的的细细胞胞壁壁厚厚度度约约为为70 nm,而而且且其其厚厚度度随随菌菌龄龄增增加加(zngji)而而增增加加(zngji
5、)。有有可可能能仅仅有有一一部部分厚度对酵母细胞壁的刚性和强度起重要作用。分厚度对酵母细胞壁的刚性和强度起重要作用。第八页,共九十一页。n结结构构:最最里里层层是是由由葡葡聚聚糖糖的的细细纤纤维维组组成成,它它构构成成了了细细胞胞壁壁的的刚刚性性骨骨架架,使使细细胞胞具具有有一一定定的的形形状状,中中间间是是一一层层糖糖蛋蛋白白,再再外外面面是是网网状状结构的结构的甘露甘露(gnl)聚糖聚糖。n破破碎碎阻阻力力主主要要决决定定于于壁壁结结构构交交联联的紧密度和壁厚度的紧密度和壁厚度第九页,共九十一页。其他其他(qt)真菌的细胞壁真菌的细胞壁n大多数真菌的细胞壁主要由大多数真菌的细胞壁主要由多糖
6、多糖组成,其次还含有组成,其次还含有较少量的较少量的蛋白质和脂类蛋白质和脂类。不同的真菌,细胞壁的组成。不同的真菌,细胞壁的组成有很大的不同,其中大多数真菌的多糖壁是由有很大的不同,其中大多数真菌的多糖壁是由几丁质和几丁质和葡聚糖葡聚糖构成构成(guchng)。n真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关,不仅如此,真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关,不仅如此,它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构,所以强度有所它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构,所以强度有所提高。提高。第十页,共九十一页。细胞壁的组成细胞壁的组成(z chn)与结构与结构第十一页,共九十一页。细胞细胞(xbo)壁的结构和细胞壁的
7、结构和细胞(xbo)破碎破碎n破碎时必须克服的主要阻力是破碎时必须克服的主要阻力是网状结构的共价键网状结构的共价键。n细细胞胞的的大大小小和和形形状状以以及及聚聚合合物物的的交交联联程程度度都都是是影影响响破破碎碎难易程度的重要因素。难易程度的重要因素。n壁壁结结构构不不仅仅取取决决于于遗遗传传信信息息也也取取决决于于生生长长环环境境,真真菌菌的壁结构还随发酵罐中混合的的壁结构还随发酵罐中混合的机械机械(jxi)作用作用而变化。而变化。第十二页,共九十一页。n虽虽然然通通过过改改变变遗遗传传(ychun)密密码码或或环环境境因因素素能能够够改改变变细细胞胞壁壁的的结结构构,但但还还没没有有实实
8、验验证证明明,该该法法能能提提高高对对机机械械破破碎碎的的敏敏感感性性,也也不不能能够够预预测测各各种种微微生生物物对对机机械械破破碎碎的的相相对对阻力。阻力。n在在用用酶酶法法或或化化学学法法来来溶溶解解细细胞胞壁壁时时,细细胞胞壁壁的的结结构构和和组组成成显显得得特特别别重重要要,可可用用来来作作为为选选择择溶溶菌菌酶酶和和化化学学方方法法的的依据。依据。第十三页,共九十一页。n第十四页,共九十一页。n第十五页,共九十一页。n化学破碎将细胞壁溶解与渗透压作用相结合,胞内外的渗透压差与胞内外低分子溶质的浓度(nngd)差c成正比=cRTR为常数第十六页,共九十一页。3.2 细胞破碎技术细胞破
9、碎技术(jsh)的分类的分类分分 类类作作 用用 机机 理理适适 应应 性性机机械械法法珠磨法珠磨法固体剪切作用固体剪切作用可达较高破碎率,可较大规模操作,可达较高破碎率,可较大规模操作,大分子目的产物易失活,浆液分离困大分子目的产物易失活,浆液分离困难难高压匀浆高压匀浆法法液体剪切作用液体剪切作用可达较高破碎率,可大规模操作,不可达较高破碎率,可大规模操作,不适合丝状菌和革兰氏阳性菌适合丝状菌和革兰氏阳性菌超声破碎超声破碎法法液体剪切作用液体剪切作用对酵母菌效果较差,破碎过程升温剧对酵母菌效果较差,破碎过程升温剧烈,不适合大规模操作烈,不适合大规模操作X-pressX-press法法固体剪切
10、作用固体剪切作用破碎率高,活性保留率高,对冷冻敏破碎率高,活性保留率高,对冷冻敏感目的产物不适合感目的产物不适合非非机机械械法法酶溶法酶溶法酶分解作用酶分解作用具有高度专一性,条件温和,浆液易具有高度专一性,条件温和,浆液易分离,溶酶价格高,通用性差分离,溶酶价格高,通用性差化学渗透化学渗透法法改变细胞膜的渗透改变细胞膜的渗透性性具一定选择性,浆液易分离,但释放具一定选择性,浆液易分离,但释放率较低,通用性差率较低,通用性差渗透压法渗透压法渗透压剧烈改变渗透压剧烈改变破碎率较低,常与其他方法结合使用破碎率较低,常与其他方法结合使用冻结融化冻结融化法法反复冻结反复冻结-融化融化破碎率较低,不适合
11、对冷冻敏感目的破碎率较低,不适合对冷冻敏感目的产物产物干燥法干燥法改变细胞膜渗透性改变细胞膜渗透性条件变化剧烈,易引起大分子物质失条件变化剧烈,易引起大分子物质失活活第十七页,共九十一页。几种细胞破碎几种细胞破碎(p su)方式的比较方式的比较机械破碎机械破碎n通过机械运动产生的剪切力,使组织、细胞破碎。通过机械运动产生的剪切力,使组织、细胞破碎。n珠磨法、挤压珠磨法、挤压(j y)法、匀浆法、超声法。法、匀浆法、超声法。物理破碎物理破碎n通通过过各各种种物物理理因因素素的的作作用用,使使组组织织、细细胞胞的的外外层层结结构构破破坏,而使细胞破碎。坏,而使细胞破碎。n温度差破碎法、压力差破碎法
12、。温度差破碎法、压力差破碎法。第十八页,共九十一页。化学破碎化学破碎n通过各种化学试剂对细胞膜的作用,而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞膜的作用,而使细胞破碎。n有机溶剂、表面活性剂、酸碱。有机溶剂、表面活性剂、酸碱。酶促破碎酶促破碎n通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用,使通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用,使细胞外层细胞外层(wi cn)结构受到破坏,而达到细胞破碎。结构受到破坏,而达到细胞破碎。n外加酶制剂法、自溶法外加酶制剂法、自溶法第十九页,共九十一页。影响破碎难易程度影响破碎难易程度(chngd)的重要因素的重要因素n机机械械法法细细胞胞的的大大小小和和形形状状、细细胞
13、胞壁壁厚厚度度、聚聚合合物物交交联联程程度度。显显然然,细细胞胞个个体体小小、球球形形、壁壁厚厚、聚聚合合物交联程度高是最难破碎物交联程度高是最难破碎(p su)的。(的。(破碎细胞破碎细胞)n非非机机械械法法细细胞胞壁壁、膜膜的的组组成成和和结结构构。了了解解细细胞胞壁壁的的组组成成和和结结构构,就就可可选选择择合合适适的的溶溶菌菌酶酶和和化化学学试试剂剂,以以及及在在使使用用多多种种酶酶或或化化学学试试剂剂相相结结合合时时确确定定其其使使用用的的顺顺序。序。(溶解壁膜上的某些组成溶解壁膜上的某些组成打洞打洞)第二十页,共九十一页。3.3 常用破碎常用破碎(p su)技术技术n珠磨法珠磨法(
14、bead mill)实验常用实验常用n高压匀浆法高压匀浆法(High-pressure homogenization)-大大规模细胞破碎的常用方法规模细胞破碎的常用方法(fngf)n超声破碎(超声破碎(Ultrasonication)-主要用于实验室主要用于实验室nx-press法法n酶溶法酶溶法研究较广的一种方法研究较广的一种方法n化学渗透法化学渗透法 其它方法其它方法第二十一页,共九十一页。珠磨法珠磨法nbead mill实验常用实验常用n工工作作原原理理:细细胞胞悬悬浮浮液液与与极极细细的的珠珠子子(玻玻璃璃、石石英英砂砂、氧氧化化铝铝等等研研磨磨剂剂,直直径径1mm)一一起起快快速速搅
15、搅拌拌或或研研磨磨,研研磨磨剂剂珠珠子子与与细细胞胞之之间间的的互互相相剪剪切切、碰碰撞撞(pn zhun),使使细细胞胞破破碎碎,释放出内含物。释放出内含物。第二十二页,共九十一页。n实验室规模:实验室规模:Mickle高速组织捣碎机、高速组织捣碎机、Braun匀浆器;匀浆器;n中试规模:胶质磨;中试规模:胶质磨;n工业工业(gngy)规模:高速珠磨机规模:高速珠磨机(High-speed bead mill)第二十三页,共九十一页。工工业业规规模模:高高速速珠珠磨磨机机。圆圆盘盘高高速速旋旋转转,使使细细胞胞悬悬液液和和玻玻璃璃珠珠相相互互搅搅动动,细细胞胞破破碎碎是是由由剪剪切切力力层层
16、之之间间 的的 碰碰 撞撞 和和 磨磨 料料(mlio)的滚动而引起。的滚动而引起。第二十四页,共九十一页。典型的珠磨机典型的珠磨机(m j)的构造的构造n瑞瑞 士士(ru sh):Dyno Mill。n磨磨室室具具夹夹套套,可可冷冷却却。在在料料液液的的出出口口处处有有一一旋旋转转的的圆圆盘盘和和出出口口平平板板(出出口口位位于于平平板板的的中中部部)很很靠靠近近,可可防防止珠体随料液带出。止珠体随料液带出。第二十五页,共九十一页。西德生产的容量西德生产的容量(rngling)20L的的LM-20型珠磨型珠磨机机第二十六页,共九十一页。胶体磨胶体磨德国进口珠磨机德国进口珠磨机第二十七页,共九
17、十一页。n除除磨磨室室以以夹夹套套冷冷却却外外,搅搅拌拌轴轴和和圆圆盘盘也也可可以以冷冷却却,圆圆盘盘交交错错地地装装在在轴轴上上,一一种种处处于于径径向向,另另一一种种和和轴轴倾倾斜斜,径径向向圆圆盘盘使使磨磨料料沿沿径径向向运运动动,而而倾倾斜斜圆圆盘盘使使产产生生铀铀内内运运动动。这种交错的运动,提高这种交错的运动,提高(t go)了破碎效率。了破碎效率。第二十八页,共九十一页。n细胞破碎率可用一级反应动力学表示细胞破碎率可用一级反应动力学表示(biosh):间歇操作:间歇操作:ln1/(1-R)=Kt连续操作:连续操作:ln1/(1-R)=K其中其中=V/F第二十九页,共九十一页。操作
18、条件操作条件(tiojin)的选择的选择n珠珠体体大大小小根根据据细细胞胞大大小小、浓浓度度以以及及连连续续操操作作时时不使珠体带出来选择。不使珠体带出来选择。n珠珠体体装装量量装装量量少少时时,细细胞胞不不易易破破碎碎;装装量量大大时时,能能量消耗大,研磨室热扩散性能降低,引起量消耗大,研磨室热扩散性能降低,引起(ynq)温度升高。温度升高。第三十页,共九十一页。n温温度度温温度度高高时时细细胞胞较较易易破破碎碎,但但要要考考虑虑目目的的产产物物不不受破坏受破坏(phui)。一般温度控制在。一般温度控制在540内时影响较小。内时影响较小。n搅搅拌拌转转速速过过高高将将使使能能量量消消耗耗大大
19、增增,而而破破碎碎率率上上升升不不明显。明显。第三十一页,共九十一页。破碎率的控制破碎率的控制(kngzh):n破碎率高时,单位破碎细胞破碎率高时,单位破碎细胞(xbo)的能耗明显上升;的能耗明显上升;n高破碎率产生较多的热能,增大了冷却控温的难度;高破碎率产生较多的热能,增大了冷却控温的难度;n破碎率越高,细胞碎片越小,分离碎片越困难;破碎率越高,细胞碎片越小,分离碎片越困难;n高破碎率下,目的产物的失活损失增加。高破碎率下,目的产物的失活损失增加。(珠珠磨磨法法的的破破碎碎率率一一般般控控制制在在80%以以下下,并并兼兼顾顾下下游游过过程)程)第三十二页,共九十一页。高压高压(goy)匀浆
20、法匀浆法n(High-pressure homogenization)大规模细胞破碎的常用方法大规模细胞破碎的常用方法n工工作作原原理理:细细胞胞悬悬浮浮液液在在高高压压的的作作用用下下从从阀阀座座与与阀阀之之间间的的环环隙隙高高速速喷喷出出,每每秒秒速速度度高高达达几几百百米米,高高速速喷喷出出的的浆浆液液又又射射到到静静止止的的撞撞击击环环上上,被被迫迫改改变变方方向向从从出出口口(ch ku)管管流流出出。细细胞胞在在这这一一系系列列高高速速运运动动过过程程中中经经历历了了剪剪切切、碰碰撞撞及及由由高高压压到到常常压压的的变变化化,从从而而造造成细胞破碎。成细胞破碎。第三十三页,共九十一
21、页。进口进口(jn ku)出口出口(ch ku)第三十四页,共九十一页。破碎破碎(p su)的动力学方程:的动力学方程:式中:式中:nKT与温度等有关的破碎常数与温度等有关的破碎常数nN悬浮液通过匀浆器的次数悬浮液通过匀浆器的次数(csh)nP操作压力操作压力na微生物种类常数微生物种类常数第三十五页,共九十一页。破碎压力破碎压力(yl)的选择:的选择:n增增大大压压力力和和增增加加(zngji)破破碎碎次次数数都都可可以以提提高高破破碎碎率率,但但当当压压力力增增大大到到一一定定程程度度后后对对匀匀浆浆器器的的磨磨损损较较大大,此此外外当当压力超过一定值后,破碎率的增加很慢。压力超过一定值后
22、,破碎率的增加很慢。n在工业生产中,通常采用的压力为在工业生产中,通常采用的压力为5570 MPa。第三十六页,共九十一页。破碎一般规律:破碎一般规律:n(1)酵母较细菌难破碎;)酵母较细菌难破碎;n(2)处处于于静静止止状状态态的的细细胞胞较较处处于于快快速速生生长长(shngzhng)状态的细胞难破碎;状态的细胞难破碎;n(3)在在复复合合培培养养基基上上培培养养的的细细胞胞比比在在简简单单合合成成培培养养基基上上培养的细胞较难破碎。培养的细胞较难破碎。第三十七页,共九十一页。不宜采用高压匀浆法破碎的有:不宜采用高压匀浆法破碎的有:n(1)易造成堵塞的团状或丝状真菌,)易造成堵塞的团状或丝
23、状真菌,n(2)较小的革兰氏阳性菌,)较小的革兰氏阳性菌,n(3)某些质地)某些质地(zhd)坚硬的亚细胞如包含体坚硬的亚细胞如包含体(inclusion body)。)。第三十八页,共九十一页。大、中、小型高压大、中、小型高压(goy)匀浆器匀浆器第三十九页,共九十一页。超声破碎超声破碎(p su)(Ultrasonication)-主要用于实验室主要用于实验室n破破碎碎机机理理:可可能能与与空空化化现现象象(Cavitation phenomena)引起的冲击波和剪切作用有关。)引起的冲击波和剪切作用有关。n通常采用的超声破碎机在通常采用的超声破碎机在1525KHz的频率下操作。的频率下操
24、作。n超超声声破破碎碎的的效效率率与与声声频频、声声能能、处处理理时时间间(shjin)、细细胞浓度及菌种类型等因素有关。胞浓度及菌种类型等因素有关。第四十页,共九十一页。超声破碎超声破碎(p su)的适用性:的适用性:n细细胞胞种种类类:杆杆菌菌比比球球菌菌较较易易破破碎碎,革革兰兰氏氏阴阴性性细细胞胞比比革兰氏阳性细胞较易破碎,对酵母菌的效果较差。革兰氏阳性细胞较易破碎,对酵母菌的效果较差。n超超声声波波振振荡荡易易引引起起(ynq)温温度度的的剧剧烈烈上上升升,操操作作时时常常在在冷冷却却条条件件下下进进行行。小小规规模模实实验验常常采采用用间间歇歇操操作作,大大规规模生产受限制。模生产
25、受限制。n超超声声波波产产生生的的化化学学自自由由基基团团能能使使某某些些敏敏感感性性活活性性物物质失活,因而有一定的局限性。质失活,因而有一定的局限性。第四十一页,共九十一页。超声波破碎时,影响生物超声波破碎时,影响生物(shngw)产品收率的因素:产品收率的因素:1、温度上升、温度上升n当气泡破裂时,绝大部分释放出来的能都以热的形当气泡破裂时,绝大部分释放出来的能都以热的形式为液体所吸收,为了避免式为液体所吸收,为了避免(bmin)高温,悬浮液应预高温,悬浮液应预先冷却到先冷却到05,并且还应用冷却液连续通入容器夹,并且还应用冷却液连续通入容器夹套,即短期的声波破碎与短期的冷却交替操作,套
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