学术讨论—第三章细胞破碎.ppt

第三章第三章 细胞细胞(xbo)破碎破碎第一页，共九十一页。生物生物(shngw)分离过程的一般流程分离过程的一般流程第二页，共九十一页。不同不同(b tn)类型的细胞分泌目标产物的类型类型的细胞分泌目标产物的类型n动物细胞：大多无细胞壁，其培养动物细胞：大多无细胞壁，其培养(piyng)产物大多分产物大多分泌在培养泌在培养(piyng)液中。液中。n植物细胞：多为植物细胞：多为胞内胞内产物。产物。n微生物：大多数小分子代谢产物分泌在微生物：大多数小分子代谢产物分泌在胞外胞外；大多数大分；大多数大分子产物和基因重组产物为子产物和基因重组产物为胞内胞内产物，如胰岛素、干扰素、产物，如胰岛素、干扰素、白细胞介素白细胞介素-2等均为胞内产物。等均为胞内产物。n对于胞内产物，首先必须将细胞破碎，使产物得以释对于胞内产物，首先必须将细胞破碎，使产物得以释放，才能进一步提取。放，才能进一步提取。第三页，共九十一页。主要主要(zhyo)内容内容n3.1 细胞壁的组成与结构细胞壁的组成与结构n3.2 细胞破碎技术细胞破碎技术(jsh)的分类的分类n3.3 常用破碎技术常用破碎技术n3.4 破碎技术的发展方向破碎技术的发展方向n3.5 破碎率的测定破碎率的测定第四页，共九十一页。3.1 细胞壁的组成细胞壁的组成(z chn)与结构与结构n微生物细胞的外围通常包括微生物细胞的外围通常包括细胞壁细胞壁和和细胞膜细胞膜。n细胞壁（外壁）：具有固定细胞外形和保护细胞免细胞壁（外壁）：具有固定细胞外形和保护细胞免受机械损伤的功能；受机械损伤的功能；n细胞膜（内壁）：具有高度选择性的半透膜，控制细胞膜（内壁）：具有高度选择性的半透膜，控制(kngzh)胞内外一些物质的交换渗透作用。胞内外一些物质的交换渗透作用。细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁。细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁。第五页，共九十一页。细菌细菌(xjn)的细胞壁的细胞壁n几乎所有细菌的细胞壁都是由坚固骨架几乎所有细菌的细胞壁都是由坚固骨架肽聚糖肽聚糖组成。组成。nG+细胞壁结构与细胞壁结构与G-有很大不同。有很大不同。n破破碎碎细细菌菌的的主主要要阻阻力力是是来来自自(li z)于于肽肽聚聚糖糖的的网网状状结结构构，其其网网结结构构的的致致密密程程度度和和强强度度取取决决于于肽肽聚聚糖糖上上所所存存在在的的肽肽键键的的数数量量和和其其交交联联的的程程度度，如如果果交交联联程程度度大大，则网结构就致密。则网结构就致密。第六页，共九十一页。第七页，共九十一页。酵母菌的细胞壁酵母菌的细胞壁主主要要成成分分：葡葡聚聚糖糖与与甘甘露露聚聚糖糖以以及及蛋蛋白白质质等等，比比革革兰兰氏氏阳阳性性菌菌稍稍厚厚，面面包包酵酵母母的的细细胞胞壁壁厚厚度度约约为为70 nm，而而且且其其厚厚度度随随菌菌龄龄增增加加(zngji)而而增增加加(zngji)。有有可可能能仅仅有有一一部部分厚度对酵母细胞壁的刚性和强度起重要作用。分厚度对酵母细胞壁的刚性和强度起重要作用。第八页，共九十一页。n结结构构：最最里里层层是是由由葡葡聚聚糖糖的的细细纤纤维维组组成成，它它构构成成了了细细胞胞壁壁的的刚刚性性骨骨架架，使使细细胞胞具具有有一一定定的的形形状状，中中间间是是一一层层糖糖蛋蛋白白，再再外外面面是是网网状状结构的结构的甘露甘露(gnl)聚糖聚糖。n破破碎碎阻阻力力主主要要决决定定于于壁壁结结构构交交联联的紧密度和壁厚度的紧密度和壁厚度第九页，共九十一页。其他其他(qt)真菌的细胞壁真菌的细胞壁n大多数真菌的细胞壁主要由大多数真菌的细胞壁主要由多糖多糖组成，其次还含有组成，其次还含有较少量的较少量的蛋白质和脂类蛋白质和脂类。不同的真菌，细胞壁的组成。不同的真菌，细胞壁的组成有很大的不同，其中大多数真菌的多糖壁是由有很大的不同，其中大多数真菌的多糖壁是由几丁质和几丁质和葡聚糖葡聚糖构成构成(guchng)。n真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关，不仅如此，真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关，不仅如此，它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度有所它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度有所提高。提高。第十页，共九十一页。细胞壁的组成细胞壁的组成(z chn)与结构与结构第十一页，共九十一页。细胞细胞(xbo)壁的结构和细胞壁的结构和细胞(xbo)破碎破碎n破碎时必须克服的主要阻力是破碎时必须克服的主要阻力是网状结构的共价键网状结构的共价键。n细细胞胞的的大大小小和和形形状状以以及及聚聚合合物物的的交交联联程程度度都都是是影影响响破破碎碎难易程度的重要因素。难易程度的重要因素。n壁壁结结构构不不仅仅取取决决于于遗遗传传信信息息也也取取决决于于生生长长环环境境，真真菌菌的壁结构还随发酵罐中混合的的壁结构还随发酵罐中混合的机械机械(jxi)作用作用而变化。而变化。第十二页，共九十一页。n虽虽然然通通过过改改变变遗遗传传(ychun)密密码码或或环环境境因因素素能能够够改改变变细细胞胞壁壁的的结结构构，但但还还没没有有实实验验证证明明，该该法法能能提提高高对对机机械械破破碎碎的的敏敏感感性性，也也不不能能够够预预测测各各种种微微生生物物对对机机械械破破碎碎的的相相对对阻力。阻力。n在在用用酶酶法法或或化化学学法法来来溶溶解解细细胞胞壁壁时时，细细胞胞壁壁的的结结构构和和组组成成显显得得特特别别重重要要，可可用用来来作作为为选选择择溶溶菌菌酶酶和和化化学学方方法法的的依据。依据。第十三页，共九十一页。n第十四页，共九十一页。n第十五页，共九十一页。n化学破碎将细胞壁溶解与渗透压作用相结合，胞内外的渗透压差与胞内外低分子溶质的浓度(nngd)差c成正比=cRTR为常数第十六页，共九十一页。3.2 细胞破碎技术细胞破碎技术(jsh)的分类的分类分分 类类作作 用用 机机 理理适适 应应 性性机机械械法法珠磨法珠磨法固体剪切作用固体剪切作用可达较高破碎率，可较大规模操作，可达较高破碎率，可较大规模操作，大分子目的产物易失活，浆液分离困大分子目的产物易失活，浆液分离困难难高压匀浆高压匀浆法法液体剪切作用液体剪切作用可达较高破碎率，可大规模操作，不可达较高破碎率，可大规模操作，不适合丝状菌和革兰氏阳性菌适合丝状菌和革兰氏阳性菌超声破碎超声破碎法法液体剪切作用液体剪切作用对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，不适合大规模操作烈，不适合大规模操作X-pressX-press法法固体剪切作用固体剪切作用破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目的产物不适合感目的产物不适合非非机机械械法法酶溶法酶溶法酶分解作用酶分解作用具有高度专一性，条件温和，浆液易具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，溶酶价格高，通用性差分离，溶酶价格高，通用性差化学渗透化学渗透法法改变细胞膜的渗透改变细胞膜的渗透性性具一定选择性，浆液易分离，但释放具一定选择性，浆液易分离，但释放率较低，通用性差率较低，通用性差渗透压法渗透压法渗透压剧烈改变渗透压剧烈改变破碎率较低，常与其他方法结合使用破碎率较低，常与其他方法结合使用冻结融化冻结融化法法反复冻结反复冻结-融化融化破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产物产物干燥法干燥法改变细胞膜渗透性改变细胞膜渗透性条件变化剧烈，易引起大分子物质失条件变化剧烈，易引起大分子物质失活活第十七页，共九十一页。几种细胞破碎几种细胞破碎(p su)方式的比较方式的比较机械破碎机械破碎n通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。n珠磨法、挤压珠磨法、挤压(j y)法、匀浆法、超声法。法、匀浆法、超声法。物理破碎物理破碎n通通过过各各种种物物理理因因素素的的作作用用，使使组组织织、细细胞胞的的外外层层结结构构破破坏，而使细胞破碎。坏，而使细胞破碎。n温度差破碎法、压力差破碎法。温度差破碎法、压力差破碎法。第十八页，共九十一页。化学破碎化学破碎n通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎。n有机溶剂、表面活性剂、酸碱。有机溶剂、表面活性剂、酸碱。酶促破碎酶促破碎n通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层细胞外层(wi cn)结构受到破坏，而达到细胞破碎。结构受到破坏，而达到细胞破碎。n外加酶制剂法、自溶法外加酶制剂法、自溶法第十九页，共九十一页。影响破碎难易程度影响破碎难易程度(chngd)的重要因素的重要因素n机机械械法法细细胞胞的的大大小小和和形形状状、细细胞胞壁壁厚厚度度、聚聚合合物物交交联联程程度度。显显然然，细细胞胞个个体体小小、球球形形、壁壁厚厚、聚聚合合物交联程度高是最难破碎物交联程度高是最难破碎(p su)的。（的。（破碎细胞破碎细胞）n非非机机械械法法细细胞胞壁壁、膜膜的的组组成成和和结结构构。了了解解细细胞胞壁壁的的组组成成和和结结构构，就就可可选选择择合合适适的的溶溶菌菌酶酶和和化化学学试试剂剂，以以及及在在使使用用多多种种酶酶或或化化学学试试剂剂相相结结合合时时确确定定其其使使用用的的顺顺序。序。（溶解壁膜上的某些组成溶解壁膜上的某些组成打洞打洞）第二十页，共九十一页。3.3 常用破碎常用破碎(p su)技术技术n珠磨法珠磨法(bead mill)实验常用实验常用n高压匀浆法高压匀浆法(High-pressure homogenization)-大大规模细胞破碎的常用方法规模细胞破碎的常用方法(fngf)n超声破碎（超声破碎（Ultrasonication）-主要用于实验室主要用于实验室nx-press法法n酶溶法酶溶法研究较广的一种方法研究较广的一种方法n化学渗透法化学渗透法 其它方法其它方法第二十一页，共九十一页。珠磨法珠磨法nbead mill实验常用实验常用n工工作作原原理理：细细胞胞悬悬浮浮液液与与极极细细的的珠珠子子(玻玻璃璃、石石英英砂砂、氧氧化化铝铝等等研研磨磨剂剂，直直径径1mm)一一起起快快速速搅搅拌拌或或研研磨磨，研研磨磨剂剂珠珠子子与与细细胞胞之之间间的的互互相相剪剪切切、碰碰撞撞(pn zhun)，使使细细胞胞破破碎碎，释放出内含物。释放出内含物。第二十二页，共九十一页。n实验室规模：实验室规模：Mickle高速组织捣碎机、高速组织捣碎机、Braun匀浆器；匀浆器；n中试规模：胶质磨；中试规模：胶质磨；n工业工业(gngy)规模：高速珠磨机规模：高速珠磨机(High-speed bead mill)第二十三页，共九十一页。工工业业规规模模：高高速速珠珠磨磨机机。圆圆盘盘高高速速旋旋转转，使使细细胞胞悬悬液液和和玻玻璃璃珠珠相相互互搅搅动动，细细胞胞破破碎碎是是由由剪剪切切力力层层之之间间 的的 碰碰 撞撞 和和 磨磨 料料(mlio)的滚动而引起。的滚动而引起。第二十四页，共九十一页。典型的珠磨机典型的珠磨机(m j)的构造的构造n瑞瑞 士士(ru sh)：Dyno Mill。n磨磨室室具具夹夹套套，可可冷冷却却。在在料料液液的的出出口口处处有有一一旋旋转转的的圆圆盘盘和和出出口口平平板板（出出口口位位于于平平板板的的中中部部）很很靠靠近近，可可防防止珠体随料液带出。止珠体随料液带出。第二十五页，共九十一页。西德生产的容量西德生产的容量(rngling)20L的的LM-20型珠磨型珠磨机机第二十六页，共九十一页。胶体磨胶体磨德国进口珠磨机德国进口珠磨机第二十七页，共九十一页。n除除磨磨室室以以夹夹套套冷冷却却外外，搅搅拌拌轴轴和和圆圆盘盘也也可可以以冷冷却却，圆圆盘盘交交错错地地装装在在轴轴上上，一一种种处处于于径径向向，另另一一种种和和轴轴倾倾斜斜，径径向向圆圆盘盘使使磨磨料料沿沿径径向向运运动动，而而倾倾斜斜圆圆盘盘使使产产生生铀铀内内运运动动。这种交错的运动，提高这种交错的运动，提高(t go)了破碎效率。了破碎效率。第二十八页，共九十一页。n细胞破碎率可用一级反应动力学表示细胞破碎率可用一级反应动力学表示(biosh)：间歇操作：间歇操作：ln1/(1-R)=Kt连续操作：连续操作：ln1/(1-R)=K其中其中=V/F第二十九页，共九十一页。操作条件操作条件(tiojin)的选择的选择n珠珠体体大大小小根根据据细细胞胞大大小小、浓浓度度以以及及连连续续操操作作时时不使珠体带出来选择。不使珠体带出来选择。n珠珠体体装装量量装装量量少少时时，细细胞胞不不易易破破碎碎；装装量量大大时时，能能量消耗大，研磨室热扩散性能降低，引起量消耗大，研磨室热扩散性能降低，引起(ynq)温度升高。温度升高。第三十页，共九十一页。n温温度度温温度度高高时时细细胞胞较较易易破破碎碎，但但要要考考虑虑目目的的产产物物不不受破坏受破坏(phui)。一般温度控制在。一般温度控制在540内时影响较小。内时影响较小。n搅搅拌拌转转速速过过高高将将使使能能量量消消耗耗大大增增，而而破破碎碎率率上上升升不不明显。明显。第三十一页，共九十一页。破碎率的控制破碎率的控制(kngzh)：n破碎率高时，单位破碎细胞破碎率高时，单位破碎细胞(xbo)的能耗明显上升；的能耗明显上升；n高破碎率产生较多的热能，增大了冷却控温的难度；高破碎率产生较多的热能，增大了冷却控温的难度；n破碎率越高，细胞碎片越小，分离碎片越困难；破碎率越高，细胞碎片越小，分离碎片越困难；n高破碎率下，目的产物的失活损失增加。高破碎率下，目的产物的失活损失增加。（珠珠磨磨法法的的破破碎碎率率一一般般控控制制在在80%以以下下，并并兼兼顾顾下下游游过过程）程）第三十二页，共九十一页。高压高压(goy)匀浆法匀浆法n(High-pressure homogenization)大规模细胞破碎的常用方法大规模细胞破碎的常用方法n工工作作原原理理：细细胞胞悬悬浮浮液液在在高高压压的的作作用用下下从从阀阀座座与与阀阀之之间间的的环环隙隙高高速速喷喷出出，每每秒秒速速度度高高达达几几百百米米，高高速速喷喷出出的的浆浆液液又又射射到到静静止止的的撞撞击击环环上上，被被迫迫改改变变方方向向从从出出口口(ch ku)管管流流出出。细细胞胞在在这这一一系系列列高高速速运运动动过过程程中中经经历历了了剪剪切切、碰碰撞撞及及由由高高压压到到常常压压的的变变化化，从从而而造造成细胞破碎。成细胞破碎。第三十三页，共九十一页。进口进口(jn ku)出口出口(ch ku)第三十四页，共九十一页。破碎破碎(p su)的动力学方程：的动力学方程：式中：式中：nKT与温度等有关的破碎常数与温度等有关的破碎常数nN悬浮液通过匀浆器的次数悬浮液通过匀浆器的次数(csh)nP操作压力操作压力na微生物种类常数微生物种类常数第三十五页，共九十一页。破碎压力破碎压力(yl)的选择：的选择：n增增大大压压力力和和增增加加(zngji)破破碎碎次次数数都都可可以以提提高高破破碎碎率率，但但当当压压力力增增大大到到一一定定程程度度后后对对匀匀浆浆器器的的磨磨损损较较大大，此此外外当当压力超过一定值后，破碎率的增加很慢。压力超过一定值后，破碎率的增加很慢。n在工业生产中，通常采用的压力为在工业生产中，通常采用的压力为5570 MPa。第三十六页，共九十一页。破碎一般规律：破碎一般规律：n（1）酵母较细菌难破碎；）酵母较细菌难破碎；n（2）处处于于静静止止状状态态的的细细胞胞较较处处于于快快速速生生长长(shngzhng)状态的细胞难破碎；状态的细胞难破碎；n（3）在在复复合合培培养养基基上上培培养养的的细细胞胞比比在在简简单单合合成成培培养养基基上上培养的细胞较难破碎。培养的细胞较难破碎。第三十七页，共九十一页。不宜采用高压匀浆法破碎的有：不宜采用高压匀浆法破碎的有：n（1）易造成堵塞的团状或丝状真菌，）易造成堵塞的团状或丝状真菌，n（2）较小的革兰氏阳性菌，）较小的革兰氏阳性菌，n（3）某些质地）某些质地(zhd)坚硬的亚细胞如包含体坚硬的亚细胞如包含体（inclusion body）。）。第三十八页，共九十一页。大、中、小型高压大、中、小型高压(goy)匀浆器匀浆器第三十九页，共九十一页。超声破碎超声破碎(p su)（Ultrasonication）-主要用于实验室主要用于实验室n破破碎碎机机理理：可可能能与与空空化化现现象象（Cavitation phenomena）引起的冲击波和剪切作用有关。）引起的冲击波和剪切作用有关。n通常采用的超声破碎机在通常采用的超声破碎机在1525KHz的频率下操作。的频率下操作。n超超声声破破碎碎的的效效率率与与声声频频、声声能能、处处理理时时间间(shjin)、细细胞浓度及菌种类型等因素有关。胞浓度及菌种类型等因素有关。第四十页，共九十一页。超声破碎超声破碎(p su)的适用性：的适用性：n细细胞胞种种类类：杆杆菌菌比比球球菌菌较较易易破破碎碎，革革兰兰氏氏阴阴性性细细胞胞比比革兰氏阳性细胞较易破碎，对酵母菌的效果较差。革兰氏阳性细胞较易破碎，对酵母菌的效果较差。n超超声声波波振振荡荡易易引引起起(ynq)温温度度的的剧剧烈烈上上升升，操操作作时时常常在在冷冷却却条条件件下下进进行行。小小规规模模实实验验常常采采用用间间歇歇操操作作，大大规规模生产受限制。模生产受限制。n超超声声波波产产生生的的化化学学自自由由基基团团能能使使某某些些敏敏感感性性活活性性物物质失活，因而有一定的局限性。质失活，因而有一定的局限性。第四十一页，共九十一页。超声波破碎时，影响生物超声波破碎时，影响生物(shngw)产品收率的因素：产品收率的因素：1、温度上升、温度上升n当气泡破裂时，绝大部分释放出来的能都以热的形当气泡破裂时，绝大部分释放出来的能都以热的形式为液体所吸收，为了避免式为液体所吸收，为了避免(bmin)高温，悬浮液应预高温，悬浮液应预先冷却到先冷却到05，并且还应用冷却液连续通入容器夹，并且还应用冷却液连续通入容器夹套，即短期的声波破碎与短期的冷却交替操作，套，即短期的声波破碎与短期的冷却交替操作，声波声波破碎破碎/冷却的时间比率称为冷却的时间比率称为“负载因素负载因素”。第四十二页，共九十一页。2 2、化学效应、化学效应n超声处理会引起诸如生成超声处理会引起诸如生成游离基游离基这样这样(zhyng)(zhyng)的化学效的化学效应，它可能对某些需要的分子带来破坏性影响，但对破应，它可能对某些需要的分子带来破坏性影响，但对破碎细胞毫无影响。碎细胞毫无影响。n可通过添加可通过添加游离基清除剂游离基清除剂如胱氨酸或谷胱甘肽，或者用如胱氨酸或谷胱甘肽，或者用氢气预吹细胞悬浮液来缓和。氢气预吹细胞悬浮液来缓和。第四十三页，共九十一页。连续超声波破碎连续超声波破碎(p su)的实验室装置的实验室装置n由由一一个个带带夹夹套套的的烧烧杯杯组组成成，其其形形状状和和尺尺寸寸会会影影响响悬悬浮浮液液的的流流体体动动力力学学。对对于于刚刚性性细细胞胞可可以以添添加加细细小小的的珠珠粒粒，产产生生辅辅助助的的研研磨磨效效应应。超超声声波波反反应应器器内内，有有四四根根内内环环管管，由由于于声声波波振振荡荡能能量量(nngling)会会泵泵送送悬悬浮浮液液循循环环，用用插插入入进进出出口口管管到到内内部部烧烧杯杯去去的的方方法法，就就可可以以实实现现连连续续操作。操作。第四十四页，共九十一页。第四十五页，共九十一页。影响超声波破碎效率影响超声波破碎效率(xio l)的参数的参数:(1)、振幅、振幅 n振幅直接与声能有关，影响蛋白质释放的比速度振幅直接与声能有关，影响蛋白质释放的比速度 k。(2)、细胞、细胞(xbo)悬浮液的粘度悬浮液的粘度 n粘度影响能耗并会抑制空穴现象。粘度影响能耗并会抑制空穴现象。第四十六页，共九十一页。(3)、表面张力、表面张力n 添加表面活性剂或从细胞中释放出表面活性物质添加表面活性剂或从细胞中释放出表面活性物质(如蛋白质如蛋白质)，能显著地影响声波破碎效率。，能显著地影响声波破碎效率。n因为强烈起泡在气一液界面上会促使蛋白质变性因为强烈起泡在气一液界面上会促使蛋白质变性(binxng)和空穴清除，特别是应用高的功率时。和空穴清除，特别是应用高的功率时。(4)、被处理悬浮液的体积、被处理悬浮液的体积 n大体积需要高的声能引起强烈涡流和大气泡形成。大体积需要高的声能引起强烈涡流和大气泡形成。第四十七页，共九十一页。(5)、珠粒的体积和直径、珠粒的体积和直径 n添加细小的珠粒，玻璃或者钢制的，不仅对空穴的形添加细小的珠粒，玻璃或者钢制的，不仅对空穴的形成有帮助，而且成有帮助，而且(r qi)产生辅助产生辅助“研磨研磨”效应，从而提效应，从而提高破碎效率。高破碎效率。n在相同珠粒填充密度下，随着珠粒直径的变化，在相同珠粒填充密度下，随着珠粒直径的变化，k存存在最大值。在最大值。第四十八页，共九十一页。(6)、探头的形状和材料、探头的形状和材料 n对于对于(duy)一个能级恒定的功率，一个能级恒定的功率，探头的振幅与其面积探头的振幅与其面积成反比，然而对于小直径的探头，声能限制在较小成反比，然而对于小直径的探头，声能限制在较小的区域并且效率低。特别是当悬浮液的体积小的时的区域并且效率低。特别是当悬浮液的体积小的时候，能量在探头嘴附近被悬浮液吸收，强烈的涡流候，能量在探头嘴附近被悬浮液吸收，强烈的涡流会变小。对于大的探头，声能消耗在大范围上，结会变小。对于大的探头，声能消耗在大范围上，结果则使振幅更小。果则使振幅更小。第四十九页，共九十一页。n探探头头嘴嘴通通常常用用钛钛制制造造，因因为为钛钛具具有有良良好好的的声声学学和和机机械械特特性性以以及及对对生生物物活活性性产产物物的的低低毒毒性性。为为了了维维修修(wixi)和和替替换换，通通常常探探头头可可以以拆拆卸卸。除除钛钛以以外外，还还可可使使用用其其他他材材料料如如不不锈锈钢钢或或硬硬质质钢钢，但但是是其其声声学学和和机机械械特性都不如钛，破碎速度也大幅度降低。特性都不如钛，破碎速度也大幅度降低。第五十页，共九十一页。n(7)、细胞、细胞(xbo)悬浮液的流速悬浮液的流速 n在在连连续续操操作作中中，流流速速取取决决于于细细胞胞在在反反应应器器中中的的停停留留时间，并影响破碎的总收率。时间，并影响破碎的总收率。n超超声声波波破破碎碎在在实实验验室室广广泛泛应应用用，但但在在工工业业范范围围中中还还未未采采用用这这种种方方法法，因因为为要要向向大大量量细细胞胞悬悬浮浮液液中中通通入入足足够够的的能能量量是很困难的。是很困难的。第五十一页，共九十一页。X-press法法n将将浓浓缩缩的的菌菌体体悬悬浮浮液液冷冷却却至至25至至30形形成成冰冰晶晶体体，利利用用500MPa以以上上的的高高压压冲冲击击，冷冷冻冻细细胞胞从从高高压压阀阀小小孔孔中中挤挤出出。细细胞胞破破碎碎是是由由于于(yuy)冰冰晶晶体体的的磨磨损损，包包埋埋在冰中的微生物的变形所引起的。在冰中的微生物的变形所引起的。n此此法法称称为为XPress法法或或Hughes press法法，主主要要用用于实验室中。于实验室中。第五十二页，共九十一页。n影响因素：影响因素：高浓度的细胞、低温、高的平均压力高浓度的细胞、低温、高的平均压力(yl)能促进破碎。能促进破碎。n优缺点：优缺点：适适用用范范围围广广，破破碎碎率率高高，细细胞胞碎碎片片的的粉粉碎碎程程度度低低、活活性性保保留留率率高高，但但是是，该该法法对对冷冷冻冻融融解解敏敏感感的的生生化化物物质质不不适用。适用。第五十三页，共九十一页。酶溶法酶溶法研究研究(ynji)较广的一种方法较广的一种方法n原原理理(yunl)：利利用用酶酶反反应应，分分解解破破坏坏细细胞胞壁壁上上的的特特殊殊键，从而达到破壁的目的。键，从而达到破壁的目的。n自自溶溶法法控控制制一一定定条条件件，诱诱发发细细胞胞自自溶溶酶酶使使细细胞胞破破碎碎。自溶法常采用加热法或干燥法。自溶法常采用加热法或干燥法。n外加酶法外加酶法根据细胞壁膜的结构及组成选择合适的酶。根据细胞壁膜的结构及组成选择合适的酶。第五十四页，共九十一页。n细菌大多细菌大多(ddu)用溶菌酶用溶菌酶(lysozyme)n酵酵母母菌菌常常用用溶溶酶酶有有：-1,3-葡葡聚聚糖糖酶酶(glucanase)、-1,6-葡葡 聚聚 糖糖 酶酶、蛋蛋 白白 酶酶(protease)、甘甘 露露 糖糖 酶酶 (mannanase)、糖糖苷苷酶酶(glycosidase)、肽肽键键内内切切酶酶(endopeptidase)、壳多糖酶等。、壳多糖酶等。第五十五页，共九十一页。细胞壁溶解细胞壁溶解(rngji)酶是几种酶的复合物酶是几种酶的复合物nG+溶菌酶、适量抑制剂溶菌酶、适量抑制剂nG-溶菌酶、溶菌酶、EDTAn放线菌放线菌 溶菌酶溶菌酶n酵母菌酵母菌 -葡聚糖酶葡聚糖酶n霉菌霉菌(mjn)几丁质酶、几丁质酶、n植物植物 纤维素酶、半纤维素酶纤维素酶、半纤维素酶第五十六页，共九十一页。酶溶法的特点酶溶法的特点(tdin)（外加酶）（外加酶）：n（1）酶溶法需要特定的反应条件。）酶溶法需要特定的反应条件。n（2）酶酶具具有有高高度度专专一一性性，必必须须根根据据细细胞胞壁壁的的结结构构和和化化学学组成选择适当的酶或溶酶系统，并确定相应的次序。组成选择适当的酶或溶酶系统，并确定相应的次序。n（3）酶酶溶溶法法的的优优点点是是：具具有有选选择择性性释释放放产产物物，条条件件温和，核酸泄出量少，细胞温和，核酸泄出量少，细胞(xbo)外形完整。外形完整。第五十七页，共九十一页。n（4）酶溶法的不足：）酶溶法的不足：n溶酶价格高；溶酶价格高；n酶溶法通用性差，且不易确定最佳的溶解条件酶溶法通用性差，且不易确定最佳的溶解条件(tiojin)；n存存在在产产物物抑抑制制，在在溶溶酶酶系系统统中中，甘甘露露糖糖对对蛋蛋白白酶酶有有抑制作用。抑制作用。第五十八页，共九十一页。自溶法（自溶法（Autolysis）u诱诱发发微微生生物物产产生生过过剩剩的的溶溶胞胞酶酶或或激激发发自自身身溶溶胞胞酶酶的的活活力力，以以达达到到(d do)细细胞胞自自溶溶的的目目的的。微微生生物物细细胞胞的的自自溶溶常常采采用用加热法和干燥法。加热法和干燥法。u影影响响自自溶溶过过程程的的主主要要因因素素有有温温度度、时时间间、pH值值、缓缓冲液浓度和细胞代谢途径等。冲液浓度和细胞代谢途径等。u缺缺点点是是：对对不不稳稳定定的的微微生生物物，易易引引起起所所需需蛋蛋白白质质的的变变性性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。第五十九页，共九十一页。化学化学(huxu)渗透法渗透法n某某些些化化学学试试剂剂，可可以以改改变变细细胞胞壁壁或或膜膜的的通通透透性性（渗渗透透性性），从从而而使使胞胞内内物物质质有有选选择择地地渗渗透透出出来来，这这种种处处理理方式称为方式称为(chn wi)化学渗透法化学渗透法(Chemical permeation)。n常常用用化化学学试试剂剂有有：有有机机溶溶剂剂、变变性性剂剂、表表面面活活性性剂剂、抗生素、金属螯合剂等。抗生素、金属螯合剂等。第六十页，共九十一页。作用作用(zuyng)原理原理n化化学学渗渗透透法法取取决决于于化化学学试试剂剂的的类类型型以以及及细细胞胞壁壁膜膜的的结结构构与与组组成成，不不同同化化学学试试剂剂作作用用的的部部位位和和方方式式有有所所不不同同，现举例如下现举例如下(rxi):n（1）表表面面活活性性物物质质：可可促促使使细细胞胞某某些些组组分分溶溶解解，其其增增溶溶作作用用有有助助于于细细胞胞的的破破碎碎。如如TritonX-100能能结结合合并并溶溶解解磷磷脂脂，破破坏坏内内膜膜的的磷磷脂脂双双分分子子层层，从从而而使使某某些胞内物质释放出来。些胞内物质释放出来。第六十一页，共九十一页。n（2）EDTA螯螯合合剂剂：可可用用于于处处理理革革兰兰氏氏阴阴性性菌菌(如如E.coli),它对其细胞它对其细胞(xbo)外层膜有破坏作用。外层膜有破坏作用。n（3）有机溶剂：能分解细胞壁中的类脂。）有机溶剂：能分解细胞壁中的类脂。n（4）变变性性剂剂：如如盐盐酸酸胍胍(Guanidin HCl)和和脲脲（Urea）与与水水中中氢氢键键作作用用，削削弱弱溶溶质质分分子子间间的的疏疏水水作作用用，从从而而使疏水性化合物溶于水溶液。使疏水性化合物溶于水溶液。第六十二页，共九十一页。n各各种种试试剂剂的的不不同同(b tn)作作用用机机理理，将将几几种种试试剂剂合合理理地地搭配使用能有效地提高胞内物质的释放率。搭配使用能有效地提高胞内物质的释放率。n例例：单单独独用用0.1mol/L盐盐酸酸胍胍处处理理E.coli仅仅释释放放约约1%的的蛋白质蛋白质 0.5%TritonX-100处理蛋白质释放率为处理蛋白质释放率为4%二者合用，蛋白质释放率可达二者合用，蛋白质释放率可达53%左右。左右。第六十三页，共九十一页。化学化学(huxu)渗透法的优点：渗透法的优点：n 对对产产物物释释放放具具有有一一定定选选择择性性。可可使使一一些些较较小小分分子子量量的的溶溶质质如如多多肽肽和和小小分分子子的的酶酶蛋蛋白白透透过过，而而核核酸酸等等大分子量的物质仍滞留在胞内。大分子量的物质仍滞留在胞内。n 细细胞胞外外形形保保持持完完整整，碎碎片片少少，浆浆液液粘粘度度低低，易易于于(yy)固液分离和进一步提取。固液分离和进一步提取。第六十四页，共九十一页。化学化学(huxu)渗透法的缺点：渗透法的缺点：n（1）通通用用性性差差，某某种种试试剂剂只只能能作作用用于于某某些些特特定定类类型型的的细细胞。胞。n（2）时时间间(shjin)长长，效效率率低低，一一般般胞胞内内物物质质释释放放率率不不超超过过50%。n（3）有些化学试剂有毒性。）有些化学试剂有毒性。第六十五页，共九十一页。反复冻结反复冻结(dngji)-融化法融化法n将将细细胞胞放放在在低低温温(dwn)下下突突然然冷冷冻冻而而在在室室温温下下缓缓慢慢融融化化，反反复多次而达到破壁作用。复多次而达到破壁作用。n一一方方面面使使细细胞胞膜膜的的疏疏水水键键结结构构破破裂裂，另另一一方方面面胞胞内内水水结结晶晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞膨胀而破裂。使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞膨胀而破裂。n适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次。适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次。第六十六页，共九十一页。渗透压法（渗透压法（Osmotic pressure）n将将细细胞胞放放在在高高渗渗透透压压的的介介质质中中（如如一一定定浓浓度度的的甘甘油油或或蔗蔗糖糖溶溶液液），达达平平衡衡后后，转转入入到到渗渗透透压压低低的的缓缓冲冲液液或或纯纯水水中中，由由于于渗渗透透压压的的突突然然变变化化，水水迅迅速速进进入入(jnr)细细胞内，引起细胞溶胀，甚至破裂。胞内，引起细胞溶胀，甚至破裂。n仅仅适适用用于于细细胞胞壁壁较较脆脆弱弱的的细细胞胞或或细细胞胞壁壁预预先先用用酶酶处处理理或或在在培培养养过过程程中中加加入入某某些些抑抑制制剂剂（如如抗抗生生素素等等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。使细胞壁有缺陷，强度减弱。第六十七页，共九十一页。干燥干燥(gnzo)法法n原原理理：干干燥燥法法可可采采用用空空气气干干燥燥，真真空空干干燥燥，喷喷雾雾干干燥燥和和冷冷冻冻干干燥燥等等。它它使使细细胞胞膜膜渗渗透透性性改改变变，当当用用丙丙酮酮、丁丁醇醇或或缓缓冲冲液液等等溶溶剂剂处处理理时时，胞胞内内物物质质(wzh)就就容容易易被被抽提出来。抽提出来。气流干燥气流干燥真空干燥真空干燥喷雾干燥喷雾干燥冷冻干燥冷冻干燥第六十八页，共九十一页。n空空气气干干燥燥主主要要适适用用于于酵酵母母菌菌，一一般般在在2530的的气气流流中中吹吹干干，然然后后用用水水、缓缓冲冲液液或或其其它它溶溶剂剂抽抽提提。空空气气干干燥燥时时，部部分分酵酵母母可可能能产产生生自自溶溶，所所以以较较冷冷冻冻干干燥燥、喷雾干燥容易喷雾干燥容易(rngy)抽提。抽提。n真空干燥真空干燥适用于细菌的干燥。适用于细菌的干燥。第六十九页，共九十一页。n冷冷冻冻干干燥燥适适用用于于较较不不稳稳定定的的生生化化物物质质，将将冷冷冻冻干干燥燥后后的菌体在冷冻条件下磨成粉，然后用缓冲液抽提。的菌体在冷冻条件下磨成粉，然后用缓冲液抽提。n有有机机溶溶剂剂脱脱水水(tu shu)：例例如如，丙丙酮酮等等使使细细胞胞脱脱水水，即即可可将将菌菌体体悬悬浮浮液液慢慢慢慢倒倒入入10倍倍体体积积预预冷冷至至20的的丙丙酮酮中中搅搅拌拌使使之之脱脱水水，丙丙酮酮除除能能脱脱水水外外，还还能能溶溶解解除除去去膜上部分脂肪，所以更容易抽提。膜上部分脂肪，所以更容易抽提。n缺缺点点：干干燥燥法法条条件件变变化化较较剧剧烈烈，容容易易引引起起蛋蛋白白质质或或其其它组织变性。它组织变性。第七十页，共九十一页。细胞细胞(xbo)破碎方法破碎方法（按是否使用外加作用力）（按是否使用外加作用力）分分 类类作作 用用 机机 理理适适 应应 性性机机械械法法珠磨法珠磨法固体剪切作用固体剪切作用可达可达较较高破碎率，高破碎率，可可较较大大规规模操作模操作，大分，大分子目的子目的产产物易失活，物易失活，浆浆液分离困液分离困难难高高压压匀匀浆浆法法液体剪切作用液体剪切作用可达可达较较高破碎率，高破碎率，可大可大规规模操作模操作，不适合，不适合丝丝状菌和革状菌和革兰兰氏阳性菌氏阳性菌超声破碎法超声破碎法液体剪切作用液体剪切作用对对酵母菌效果酵母菌效果较较差，破碎差，破碎过过程升温程升温剧剧烈，烈，不适合大不适合大规规模操作模操作X-pressX-press法法固体剪切作用固体剪切作用破碎率高，活性保留率高，破碎率高，活性保留率高，对对冷冷冻冻敏感目敏感目的的产产物不适合物不适合非非机机械械法法酶酶溶法溶法酶酶分解作用分解作用具有高度具有高度专专一性，条件温和，一性，条件温和，浆浆液易分离，液易分离，溶溶酶酶价格高，通用性差价格高，通用性差化学渗透法化学渗透法改改变细变细胞膜的渗透胞膜的渗透性性具一定具一定选择选择性，性，浆浆液易分离，但液易分离，但释释放率放率较较低，通用性差低，通用性差渗透渗透压压法法渗透渗透压剧压剧烈改烈改变变破碎率破碎率较较低，常与其他方法低，常与其他方法结结合使用合使用冻结冻结融化法融化法反复反复冻结冻结-融化融化破碎率破碎率较较低，不适合低，不适合对对冷冷冻冻敏感目的敏感目的产产物物干燥法干燥法改改变细变细胞膜渗透性胞膜渗透性条件条件变变化化剧剧烈，易引起大分子物烈，易引起大分子物质质失活失活第七十一页，共九十一页。选择选择(xunz)破碎方法的依据破碎方法的依据n（1）细细胞胞处处理理量量：大大规规模模生生产产多多采采用用机机械械法法（通通用用性性强强，破破碎碎效效率率高高），实实验验室室规规模模多多选选用用非非机机械械法法（选选择择性好，固液易分离性好，固液易分离(fnl)）。）。n（2）细胞壁的强度与结构：见）细胞壁的强度与结构：见3.2。n（3）目目标标产产物物对对破破碎碎条条件件的的敏敏感感性性：对对活活性性物物质质产产品，要兼顾效率与稳定性。品，要兼顾效率与稳定性。n（4）破破碎碎程程度度：操操作作条条件件要要兼兼顾顾产产物物释释放放率率、能能耗和便于后提取。耗和便于后提取。第七十二页，共九十一页。n任任何何破破壁壁方方法法都都有有局局限限性性和和不不足足，应应根根据据破破壁壁目目的的、产产物物(chnw)(chnw)的的类类型型和和位位置置，选选用用合合适适的的方方法法，达达到到选选择择性性地分步释放目标产物地分步释放目标产物(chnw)(chnw)的要求。的要求。第七十三页，共九十一页。n其一般原则为其一般原则为:1)1)若提取的产物在细胞质内，需用机械破碎法。若提取的产物在细胞质内，需用机械破碎法。2)2)若在细胞膜附近则可用较温和的非机械法若在细胞膜附近