学术讨论—第五章-抗-体-制-药.ppt
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1、第五章第五章 抗抗 体体 制制 药药第一页,共六十九页。第一节第一节 概概 述述 1890年年Behring和北里柴三郎等人发现白喉抗毒素,并建立了血清和北里柴三郎等人发现白喉抗毒素,并建立了血清(xuqng)疗法,开抗体制药疗法,开抗体制药之先河。之先河。1937年年Tiselius等人用电泳法将血清分为白蛋白、甲种(等人用电泳法将血清分为白蛋白、甲种()球蛋白、乙种()球蛋白、乙种()球蛋白、丙种()球蛋白、丙种()球蛋白,并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。)球蛋白,并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。第二页,共六十九页。抗体指能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。它抗体
2、指能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。它是机体免疫系统受抗原物质刺激后,是机体免疫系统受抗原物质刺激后,B B淋巴细胞被活化、增殖和分化淋巴细胞被活化、增殖和分化为浆细胞,由浆细胞合成和分泌的球蛋白。为浆细胞,由浆细胞合成和分泌的球蛋白。病人血清中具有抗体活性及化学结构与抗体相似的球蛋白,病人血清中具有抗体活性及化学结构与抗体相似的球蛋白,称为免疫球蛋白(称为免疫球蛋白(Immunoglobulin,IgImmunoglobulin,Ig)。)。Ig Ig是化学结构的概念,而抗体是生物学功能的概念,所有抗体是是化学结构的概念,而抗体是生物学功能的概念,所有抗体是IgIg,但并,但并非
3、所有非所有IgIg分子都有抗体活性。分子都有抗体活性。由于病原微生物是含有多种抗原决定由于病原微生物是含有多种抗原决定(judng)(judng)族的抗原物质,族的抗原物质,因此制的这些抗体制剂也是多种抗体的混合物,故称为多克隆抗体。因此制的这些抗体制剂也是多种抗体的混合物,故称为多克隆抗体。易出现非特异性交叉反应。易出现非特异性交叉反应。1975 1975年年Khler and MilsteinKhler and Milstein等首次利用等首次利用B B淋巴细胞杂交瘤技术制备出淋巴细胞杂交瘤技术制备出 McAb.McAb.在临床上主要用于诊断和治疗。在临床上主要用于诊断和治疗。第三页,共六
4、十九页。McAb 在免疫导向疗法中存在的问题(障碍):在免疫导向疗法中存在的问题(障碍):A、McAb均是鼠源性抗体,应用于人体内可产生人抗鼠抗体(均是鼠源性抗体,应用于人体内可产生人抗鼠抗体(HAMA),加速了排斥),加速了排斥反应反应(fnyng),在人体内的半衰期只有,在人体内的半衰期只有56h,难以维持有效药物作用靶组织时间;,难以维持有效药物作用靶组织时间;B、完整的抗体分子的相对分子质量过大,难以穿透实体肿瘤组织,达不到有效的治疗浓度。、完整的抗体分子的相对分子质量过大,难以穿透实体肿瘤组织,达不到有效的治疗浓度。需要解决的问题:需要解决的问题:A、降低、降低McAb的免疫源性;的
5、免疫源性;B、降低、降低McAb的相对分子质量。的相对分子质量。解决问题的方法或途径解决问题的方法或途径基因工程技术基因工程技术 1984年报道了人年报道了人鼠嵌合抗体,之后制备出了改型抗体、单链抗体、单域抗体、最小鼠嵌合抗体,之后制备出了改型抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等多种类型,基本上消除了抗体的鼠源性(免疫源性),相对分子质量只有完整识别单位等多种类型,基本上消除了抗体的鼠源性(免疫源性),相对分子质量只有完整抗体分子的抗体分子的1/801/3。第四页,共六十九页。第二节第二节 单克隆抗体单克隆抗体(kngt)(Monoclonal Antibody)一、制备单克隆抗体的一般流
6、程一、制备单克隆抗体的一般流程 McAb McAb是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合,是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合,通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。由于这种抗体是针对而产生的。由于这种抗体是针对(zhndu)(zhndu)一个抗原决定族的抗体,一个抗原决定族的抗体,又是单一的又是单一的B B淋巴细胞克隆产生的,故称为单克隆抗体。淋巴细胞克隆产生的,故称为单克隆抗体。第五页,共六十九页。第六页,共六十九页。第七页,共六十九页。1、抗原与动物免疫、抗原与动物免疫 免疫方法
7、:体内免疫和体外免疫免疫方法:体内免疫和体外免疫 抗原:颗粒性抗原和可溶性抗原抗原:颗粒性抗原和可溶性抗原 免疫动物:免疫动物:BALB/c小鼠和小鼠和Lou大鼠大鼠 2、细胞融合与杂交瘤细胞的选择培养、细胞融合与杂交瘤细胞的选择培养 基本基本(jbn)方法:取适量脾细胞(方法:取适量脾细胞(1108)与骨髓瘤细胞()与骨髓瘤细胞(21073107)进行混合,在)进行混合,在PEG作用下诱导它们融合,时间控制在作用下诱导它们融合,时间控制在2min以内,然后用培养液将以内,然后用培养液将PEG融合液缓慢稀释融合液缓慢稀释。第八页,共六十九页。第九页,共六十九页。用于细胞融和的骨髓瘤细胞应具备融
8、和率高,自身不分泌抗体,所产用于细胞融和的骨髓瘤细胞应具备融和率高,自身不分泌抗体,所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力强且长期稳定等特点。生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力强且长期稳定等特点。PEG的相对分子质量和浓度越大,其促融和率越高。但其黏度和对细胞的相对分子质量和浓度越大,其促融和率越高。但其黏度和对细胞的毒性也随之增大。常用浓度为的毒性也随之增大。常用浓度为40%50%,相对分子质量,相对分子质量4000为佳。相对为佳。相对分子质量在分子质量在4006000,浓度在,浓度在10%60%范围内的范围内的PEG都能使细胞发生融合。都能使细胞发生融合。为了为了(wi le)提高融合率,在提高融合率
9、,在PEG 溶液中加入溶液中加入DMSO(二甲基亚砜二甲基亚砜),以提高),以提高细胞接触的紧密性,增加融合率。但必须严格限制接触时间。细胞接触的紧密性,增加融合率。但必须严格限制接触时间。(1)细胞融合液中的细胞类型:)细胞融合液中的细胞类型:4或或5种。种。(2)如何去除脾如何去除脾-瘤融和细胞以外的细胞?常用选择性培养基瘤融和细胞以外的细胞?常用选择性培养基第十页,共六十九页。第十一页,共六十九页。第十二页,共六十九页。第十三页,共六十九页。3 3、筛选阳性克隆与克隆化、筛选阳性克隆与克隆化 常用的检测方法:免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫常用的检测方法:免疫酶技术、免疫荧光技术、放射
10、免疫技术技术 常用的克隆化方法:有限稀释法和软琼脂法。常用的克隆化方法:有限稀释法和软琼脂法。有限稀释法:把杂交瘤细胞悬液稀释后,加入到有限稀释法:把杂交瘤细胞悬液稀释后,加入到9696孔板,使每孔中在理论上只含有一个孔板,使每孔中在理论上只含有一个(y)(y)细胞。第一次细胞。第一次克隆化时也要应用克隆化时也要应用HTHT培养液,以后的克隆化可用不含培养液,以后的克隆化可用不含HTHT的的RPMI 1640RPMI 1640培养液。培养液。软琼脂法:在培养液中加入软琼脂法:在培养液中加入0.5%0.5%的琼脂糖凝胶,细胞分裂后的琼脂糖凝胶,细胞分裂后形成小球样团块,由于培养基是半固体状态,可
11、用吸管吸出,移形成小球样团块,由于培养基是半固体状态,可用吸管吸出,移入入9696孔板培养。孔板培养。第十四页,共六十九页。第十五页,共六十九页。第十六页,共六十九页。4、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定(jindng)染色体分析染色体分析 正常鼠的脾细胞染色体数:正常鼠的脾细胞染色体数:40,全部为端着丝粒。,全部为端着丝粒。小鼠骨髓瘤细胞染色体:小鼠骨髓瘤细胞染色体:SP2/0细胞为细胞为6268,NS-1为为5464,大多数,大多数为非整倍性,有中部和亚中部着丝点。为非整倍性,有中部和亚中部着丝点。杂交瘤细胞的染色体数目:接近两亲本细胞染色体数目的总和,杂交瘤细胞的
12、染色体数目:接近两亲本细胞染色体数目的总和,在结构上多数为端着丝粒染色体外,还应出现少数标志染色体。在结构上多数为端着丝粒染色体外,还应出现少数标志染色体。染色体数目多且较集中的杂交瘤细胞分泌高效价的抗体;反之,则染色体数目多且较集中的杂交瘤细胞分泌高效价的抗体;反之,则反。反。第十七页,共六十九页。5 5、单克隆抗体的大量制备、单克隆抗体的大量制备 (1 1)体外培养法:可获得)体外培养法:可获得10g/ml10g/ml的抗体。多采用的抗体。多采用RPMI 1640RPMI 1640培养液,培养液,添加添加10%-20%10%-20%胎牛或小牛血清。但由于培养液中含有血清成分,总蛋白胎牛或小
13、牛血清。但由于培养液中含有血清成分,总蛋白量可达量可达100 g/ml100 g/ml以上,给纯化以上,给纯化(chn hu)(chn hu)带来困难。加入小牛血清又是发带来困难。加入小牛血清又是发生支原体污染的原因,而且批间质量差异太大,直接影响杂交瘤细胞的生支原体污染的原因,而且批间质量差异太大,直接影响杂交瘤细胞的生长。生长。改良的方法有:无血清培养法、悬浮培养法、微载体悬浮培养改良的方法有:无血清培养法、悬浮培养法、微载体悬浮培养法。法。无血清培养法:利用白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺等混合物代替小牛无血清培养法:利用白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺等混合物代替小牛血清。此法虽可减少
14、污染,但产量不高。血清。此法虽可减少污染,但产量不高。悬浮培养法:连续悬浮培养的细胞密度可达悬浮培养法:连续悬浮培养的细胞密度可达2 210107 7/ml,/ml,收集的单克隆抗收集的单克隆抗体可达体可达400 g/ml400 g/ml。如在培养液中加入微载体,细胞密度可达。如在培养液中加入微载体,细胞密度可达10108 8/ml/ml。第十八页,共六十九页。(2)动物体内诱生法:可获得)动物体内诱生法:可获得(hud)10g/ml的抗体。常用的抗体。常用 基本程序:接种前基本程序:接种前12周,小鼠腹腔注射周,小鼠腹腔注射0.5ml Pristane(降植烷)或(降植烷)或用液体石蜡,然后
15、注射用液体石蜡,然后注射1*106杂交瘤细胞,杂交瘤细胞,712d便有腹水生成,待生成便有腹水生成,待生成腹水后再提取,离心去细胞沉淀,取上清液冻存。腹水后再提取,离心去细胞沉淀,取上清液冻存。优点:操作简便,比较经济,所得单克隆抗体量多且效价高,还可有效优点:操作简便,比较经济,所得单克隆抗体量多且效价高,还可有效地保存杂交瘤细胞株和分离已污染杂菌的杂交瘤细胞株。地保存杂交瘤细胞株和分离已污染杂菌的杂交瘤细胞株。缺点:小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白,给纯化带来难度。缺点:小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白,给纯化带来难度。第十九页,共六十九页。6 6、单克隆抗体、单克隆抗体(kngt)(
16、kngt)的纯化的纯化 根据根据IgIg的类和亚类以及用途选择不的类和亚类以及用途选择不同的纯化方法。同的纯化方法。体外诊断试剂体外诊断试剂IgGIgG类类-沉淀处理沉淀处理+亲和层析亲和层析 IgM IgM类类-沉淀处理沉淀处理+凝胶过滤凝胶过滤 体内诊断试剂或治疗用药体内诊断试剂或治疗用药-亲和亲和层析层析+阴离子交换层析,注意除去毒素、阴离子交换层析,注意除去毒素、病毒、核酸等微量的污染物。病毒、核酸等微量的污染物。第二十页,共六十九页。动物体内诱生法制备的动物体内诱生法制备的McAb纯化的一般程序:纯化的一般程序:(1)澄清和沉淀处理:)澄清和沉淀处理:a.1000g 离心离心5min
17、,去除沉淀物(红细胞、细胞碎块、纤维蛋白凝块和,去除沉淀物(红细胞、细胞碎块、纤维蛋白凝块和脂质)脂质)b.20 000g 高速离心高速离心30min,去除残留的小颗粒物质去除残留的小颗粒物质c.用用0.2 m微孔微孔(wi kn)滤膜过滤,去除细菌、支原体滤膜过滤,去除细菌、支原体d.饱和硫酸铵沉淀抗体(饱和硫酸铵沉淀抗体(50%饱和硫酸铵能回收饱和硫酸铵能回收90%以上的抗体)。以上的抗体)。第二十一页,共六十九页。(2 2)分离)分离 A A、凝胶过滤:用于、凝胶过滤:用于IgGIgG和和IgMIgM类。常用类。常用SephadexG 200 SephadexG 200 作为分离介质,可
18、收集到作为分离介质,可收集到3 3个峰,最高峰为个峰,最高峰为IgMIgM,另外,另外(ln wi)(ln wi)两个峰为两个峰为 IgG IgG。抗体回收率达。抗体回收率达5080%5080%,能去,能去除污染的微量杂蛋白,抗体纯度可达除污染的微量杂蛋白,抗体纯度可达95%95%以上。以上。B B、阴离子交换层析:用于、阴离子交换层析:用于IgGIgG类的分离纯化。在类的分离纯化。在pH7.4pH7.4条件下,条件下,IgG1IgG1和和IgG2IgG2能结能结合在合在DEAEDEAE填料上,其中填料上,其中IgG2aIgG2a可在较低离子强度下洗脱下来,其纯度很高。可在较低离子强度下洗脱下
19、来,其纯度很高。IgG2b IgG2b和和IgG3IgG3在低离子强度下易发生沉淀,可增加离子强度以提高产量,但其纯度相对在低离子强度下易发生沉淀,可增加离子强度以提高产量,但其纯度相对较低。较低。C C、亲和层析:多用蛋白、亲和层析:多用蛋白A A亲和层析。适用于亲和层析。适用于IgGIgG类。类。IgGIgG类与蛋白类与蛋白A A的结合与的结合与pH pH 有密切的关系。鼠源性单抗在有密切的关系。鼠源性单抗在 pH8.0 pH8.0时,时,IgG2bIgG2b、IgG3IgG3几乎全部结合在蛋几乎全部结合在蛋白白 A A柱上,柱上,IgG1 IgG1稍差,用稍差,用 pH3.5 pH3.5
20、缓冲液可洗脱下缓冲液可洗脱下 IgG2b IgG2b,pH4.0pH4.0缓冲液可洗缓冲液可洗脱下脱下 IgG3 IgG3,pH4.5pH4.5缓冲液可洗脱下缓冲液可洗脱下IgG2aIgG2a,pH6.0 pH6.0可洗脱下可洗脱下IgG1IgG1。用蛋白。用蛋白A A亲亲和层析收获的抗体纯度和很高,但也有极微量的杂蛋白。和层析收获的抗体纯度和很高,但也有极微量的杂蛋白。第二十二页,共六十九页。二、鼠源性单克隆抗体的改造二、鼠源性单克隆抗体的改造 目的目的(md)(md):一是降低免疫源性;:一是降低免疫源性;二是降低相对分子量,增加组织通透性。二是降低相对分子量,增加组织通透性。原理:抗体同
21、抗原结合的功能决定于抗体分原理:抗体同抗原结合的功能决定于抗体分子的可变区(子的可变区(V V),同种性免疫源性则决定于抗),同种性免疫源性则决定于抗体分子的稳定区(体分子的稳定区(C C)。)。第二十三页,共六十九页。第二十四页,共六十九页。第二十五页,共六十九页。第二十六页,共六十九页。第二十七页,共六十九页。鼠源性单克隆抗体的改造鼠源性单克隆抗体的改造 1 1、人、人鼠嵌合抗体(鼠嵌合抗体(chimeric antibodychimeric antibody):在基因水平上把鼠源性单克隆抗体的:在基因水平上把鼠源性单克隆抗体的H H和和L L链的链的V V区基因分离出来,分别与人区基因分
22、离出来,分别与人IgIg的的H H链和链和L L链的链的C C区基因连接,即成为人区基因连接,即成为人鼠嵌合抗体的鼠嵌合抗体的H H和和L L链基因,再共转染骨髓瘤细胞,就能表达出完整的链基因,再共转染骨髓瘤细胞,就能表达出完整的Chimeric Antibody.Chimeric Antibody.2 2、改型抗体、改型抗体(Reshaping antibody)(Reshaping antibody):IgIg分子中参与构成抗原结合部位的区域是分子中参与构成抗原结合部位的区域是 H H和和L L链链 V V区中的互补性决定区区中的互补性决定区(CDR(CDR区区)。如果用鼠源性单克隆抗体的
23、。如果用鼠源性单克隆抗体的CDRCDR序列序列(xli)(xli)替换人替换人 Ig Ig分子中分子中的的CDRCDR序列序列(xli)(xli),则可使人的,则可使人的 Ig Ig分子具有鼠源性单克隆抗体的抗原结合特异性。抗体分子中分子具有鼠源性单克隆抗体的抗原结合特异性。抗体分子中鼠源部分只占很小比例,可基本消除免疫源性。这种改型抗体也称鼠源部分只占很小比例,可基本消除免疫源性。这种改型抗体也称CDRCDR移植抗体移植抗体(CDR (CDR grafting antibody)grafting antibody)。3 3、小分子抗体:基因工程小分子抗体仅表达鼠源性单克隆抗体的、小分子抗体:
24、基因工程小分子抗体仅表达鼠源性单克隆抗体的V V区片段,其相对分子质区片段,其相对分子质量仅为原抗体的量仅为原抗体的1/801/31/801/3。(1)Fab (1)Fab片段抗体:片段抗体:V VH H+C+CH1H1 (3)(3)单链抗体:单链抗体:V VH H-Linker-V-Linker-VL L (2)FV (2)FV抗体:抗体:V VH H+V+VL L (4)(4)单域抗体:单域抗体:V VH H或或V VL L (5 5)最小识别单位()最小识别单位(MRUMRU):单个):单个CDRCDR区构成区构成 第二十八页,共六十九页。4、双功能抗体:双特异性抗体、双功能抗体:双特异
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- 精品 医学 专题 第五
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