学术讨论—上海儿童医院.ppt
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1、串联质谱技术(jsh)新生儿遗传代谢病筛查上海市儿童医院田国力(gul)第一页,共四十七页。遗传(ychun)(ychun)代谢病n遗传性代谢病(遗传性代谢病(Inborn Errors of Metabolism,IEMInborn Errors of Metabolism,IEM)是是由于基因改变导致某些酶或蛋白质功能发生质由于基因改变导致某些酶或蛋白质功能发生质/量的改变,量的改变,引起某些代谢途径引起某些代谢途径(tjng)(tjng)上的生化物质发生改变引起一系列疾病。上的生化物质发生改变引起一系列疾病。n大多数为单基因遗传病大多数为单基因遗传病n遗传方式以常染色体隐性遗传或遗传方式
2、以常染色体隐性遗传或X X连锁隐性遗传为主连锁隐性遗传为主第二页,共四十七页。遗传(ychun)(ychun)代谢病发病机制异异常常代代谢谢途途径径代谢物代谢物(A1)代谢物代谢物(C1)代谢物代谢物 (B1)代谢物代谢物(A2)代谢物代谢物(C2)代谢物代谢物(B2)代谢物代谢物(A)代谢物代谢物(B)辅酶(辅酶(C)正常正常代谢代谢途径途径酶酶第三页,共四十七页。疾病(jbng)(jbng)特点n目前已发现目前已发现500500余种疾病余种疾病n主主要要类类型型有有氨氨基基酸酸代代谢谢障障碍碍、有有机机酸酸血血症症、脂脂肪肪酸酸代代谢谢障障碍碍、核核酸酸代代谢谢异异常常症症、金金属代谢障碍
3、、线粒体病属代谢障碍、线粒体病n80%80%属常染色体隐性遗传属常染色体隐性遗传n单病发生率低,群体患病率高单病发生率低,群体患病率高n单基因缺陷所致代谢通路阻单基因缺陷所致代谢通路阻,大多为单基因遗传病,少数为线粒体基因遗传病大多为单基因遗传病,少数为线粒体基因遗传病n表现非特异性,有赖遗传学或生化方法确诊,代谢物、酶学和分子检测表现非特异性,有赖遗传学或生化方法确诊,代谢物、酶学和分子检测n常规试验检测:缺乏特异常规试验检测:缺乏特异(ty)(ty)标志物标志物n儿科、血液科、神经科、骨科等不同诊室就诊儿科、血液科、神经科、骨科等不同诊室就诊n早期症状多无特异性,累及部位和病情轻重差异很大
4、,极易造成误诊早期症状多无特异性,累及部位和病情轻重差异很大,极易造成误诊n新生儿期、幼儿或儿童期发病新生儿期、幼儿或儿童期发病,某些可至成人期开始发病。某些可至成人期开始发病。第四页,共四十七页。临床(ln chun)特征n多在新生儿期、幼儿或儿童期发病。某些可至成人期开始发病。多在新生儿期、幼儿或儿童期发病。某些可至成人期开始发病。n新生儿期发病:呕吐、喂奶困难、反应力低下、呼吸暂停、急促等新生儿期发病:呕吐、喂奶困难、反应力低下、呼吸暂停、急促等n儿童期发病:可表现为全身多器官受累儿童期发病:可表现为全身多器官受累n以神经肌肉系统以神经肌肉系统(xtng)(xtng)、呼吸系统、呼吸系统
5、(xtng)(xtng)、消化系统、消化系统(xtng)(xtng)等症状为主等症状为主n乏力、智力发育迟缓、肌张力增高或降低、癫痫、黄疸、肝脾肿大、呼吸困难乏力、智力发育迟缓、肌张力增高或降低、癫痫、黄疸、肝脾肿大、呼吸困难n代谢性酸中毒、容貌异常、毛发皮肤色素改变、特殊体味代谢性酸中毒、容貌异常、毛发皮肤色素改变、特殊体味n饮食、应激反应、体能消耗等为疾病急性发作诱因。饮食、应激反应、体能消耗等为疾病急性发作诱因。第五页,共四十七页。遗传(ychun)(ychun)代谢病诊断困难n临床症状和体征:缺乏特异性临床症状和体征:缺乏特异性n常规检测:缺乏特异标志物常规检测:缺乏特异标志物n特殊试
6、验检测特殊试验检测n氨基酸分析:氨基酸自动分析仪,高效液相色谱氨基酸分析:氨基酸自动分析仪,高效液相色谱n酰基肉碱分析酰基肉碱分析n串联质谱技术串联质谱技术n气相质谱气相质谱技术技术n酶学分析酶学分析n基因诊断基因诊断n组织活检、成纤维细胞组织培养、脑脊液培养、其他组织活检、成纤维细胞组织培养、脑脊液培养、其他(qt)(qt)神经病学检查神经病学检查第六页,共四十七页。PKU历史(lsh)n体内高体内高PhePhe引起引起(ynq)(ynq)患患儿智力低下儿智力低下n19301930提出低苯丙氨酸饮食提出低苯丙氨酸饮食治疗治疗n19501950应用饮食治疗应用饮食治疗n仅对仅对PKUPKU同胞
7、有益同胞有益n大多患儿出现不可逆症大多患儿出现不可逆症状后才确诊状后才确诊n19631963年美国新生儿年美国新生儿PKUPKU筛查筛查Pediatrics,105:89,2000.第七页,共四十七页。重视遗传代谢(dixi)(dixi)病筛查与诊断n疾病疾病谱的改的改变(gibin)n感染性疾病、重度感染性疾病、重度营养不良、养不良、肿瘤、先天畸形、瘤、先天畸形、遗传代代谢性疾病性疾病n诊断技断技术的的进步步n生化生化检测、基因芯片、全基因、基因芯片、全基因组测序等序等n治治疗方法的提高方法的提高n替代治替代治疗、系、系谱分析、分析、遗传咨咨询、器官移植、基因治、器官移植、基因治疗n国内外国
8、内外对出生缺陷的重出生缺陷的重视第八页,共四十七页。新生儿遗传(ychun)(ychun)代谢病筛查n对新生儿遗传代谢缺陷、先天性内分泌异常以及某些严重的遗对新生儿遗传代谢缺陷、先天性内分泌异常以及某些严重的遗传性疾病进行筛查的总称传性疾病进行筛查的总称n患病新生儿在临床症状出现前能给予治疗,防止或减轻体格和智力患病新生儿在临床症状出现前能给予治疗,防止或减轻体格和智力发育障碍,避免痴呆或死亡的发生发育障碍,避免痴呆或死亡的发生n是当今国际上早期是当今国际上早期(zoq)(zoq)发现遗传代谢病患儿的有效措施发现遗传代谢病患儿的有效措施第九页,共四十七页。n是集筛查、早期诊断、及时治疗、预防再
9、发等措施为一体是集筛查、早期诊断、及时治疗、预防再发等措施为一体n减少出生缺陷,提高人口素质减少出生缺陷,提高人口素质n是当今国际上早期发现遗传是当今国际上早期发现遗传(ychun)(ychun)代谢病患儿的有效措施代谢病患儿的有效措施n预防效果显著,成本效益最好预防效果显著,成本效益最好 新生儿遗传(ychun)(ychun)代谢病筛查第十页,共四十七页。新生儿遗传(ychun)代谢病筛查技术n细菌抑制法细菌抑制法:BIA:BIAn荧光法:荧光法:FIA,EFIAFIA,EFIAn免疫法:免疫法:ELISA,DELFIAELISA,DELFIAn串联质谱仪:一次检测,多种疾病。检测串联质谱仪
10、:一次检测,多种疾病。检测氨基酸代谢异常,脂肪酸代谢异常和有机氨基酸代谢异常,脂肪酸代谢异常和有机酸代谢异常。酸代谢异常。nMicroarray platformMicroarray platform:分子基因的研究,:分子基因的研究,将将DNADNA点在玻璃芯片上,然后与荧光点在玻璃芯片上,然后与荧光标记的诊断标记的诊断(zhndun)(zhndun)探针反应,检探针反应,检测响应荧光信号测响应荧光信号n数字微流体数字微流体(Digital Microfluidics):(Digital Microfluidics):用于溶用于溶酶体贮积病的筛查酶体贮积病的筛查第十一页,共四十七页。串联(c
11、hunlin)质谱筛查的优势一种疾病一种疾病一种测试一种测试(csh)(csh)多种疾病多种疾病多种测试多种测试新生儿筛查方案的扩展新生儿筛查方案的扩展 将非常昂贵将非常昂贵一份血样同时检测超过一份血样同时检测超过3030多种物质,近多种物质,近4040种种 代谢疾病。代谢疾病。高灵敏性、高选择性高灵敏性、高选择性高灵敏性、高选择性高灵敏性、高选择性快速检测,达到早诊断、早治疗的效果快速检测,达到早诊断、早治疗的效果快速检测,达到早诊断、早治疗的效果快速检测,达到早诊断、早治疗的效果(xiogu)(xiogu)(xiogu)(xiogu)降低了筛查诊断的假阳性和假阴性降低了筛查诊断的假阳性和假
12、阴性降低了筛查诊断的假阳性和假阴性降低了筛查诊断的假阳性和假阴性VS.传统筛查 串串联质谱MS/MSMS/MS是一种在同一样本中同时测量多种待测物的方法是一种在同一样本中同时测量多种待测物的方法在同个测试平台上检测多个疾病就变得可能在同个测试平台上检测多个疾病就变得可能第十二页,共四十七页。质谱仪组成(z chn)nMSMS仪主要由离子源、真空接口、质量分析器、检测器等四部分仪主要由离子源、真空接口、质量分析器、检测器等四部分(b(b fen)fen)组成组成n样品中被测物质在离子源内电离形成各种质荷比不同带电离子样品中被测物质在离子源内电离形成各种质荷比不同带电离子(离子化),经真空接口进入
13、由电场或磁场形成的质量分析器,(离子化),经真空接口进入由电场或磁场形成的质量分析器,利用电磁学原理,根据利用电磁学原理,根据m/zm/z不同将带电离子分开,最后到达检测不同将带电离子分开,最后到达检测器被检测,得到样品的质谱图及离子强度器被检测,得到样品的质谱图及离子强度第十三页,共四十七页。质谱的基本原理n将分析物离子化为各种将分析物离子化为各种(zhn)(zhn)质荷比质荷比(m/z)(m/z)不同的带电粒子不同的带电粒子n应用电磁学原理应用电磁学原理,带电粒子按带电粒子按m/zm/z在空间或时间上产生分离排列成在空间或时间上产生分离排列成的图谱的图谱n根据它们所形成的谱图、离子峰强度对
14、分析物进行鉴定根据它们所形成的谱图、离子峰强度对分析物进行鉴定n若同时加入被检测物质对应的内标或外标,既可以进行定量检测。若同时加入被检测物质对应的内标或外标,既可以进行定量检测。第十四页,共四十七页。MS/MSMS/MS的基本原理n两个两个MSMS经碰撞室经碰撞室(CID)(CID)串联而成串联而成n最常应用于最常应用于NBSNBS的是三重四极杆,由两个的是三重四极杆,由两个MSMS经碰撞室经碰撞室(CID)(CID)串联而串联而成成n一级一级MSMS是功能类似于气相和液相色谱的分离器,只允许选择的离子是功能类似于气相和液相色谱的分离器,只允许选择的离子(母离子母离子)通过通过n母离子进人母
15、离子进人CIDCID产生碎片产生碎片(子离子子离子)n子离子经二级子离子经二级MSMS选择最终进入选择最终进入(jnr)(jnr)检测器检测器n通过不同扫描的方式记录即可得到串联质谱图谱,通过不同扫描的方式记录即可得到串联质谱图谱,实现对待测物实现对待测物的定性的定性n通过样品中加入定量同位素内标,实现待测物定量检测通过样品中加入定量同位素内标,实现待测物定量检测第十五页,共四十七页。串联(chunlin)质谱仪一级质谱一级质谱碰撞室碰撞室二级质谱二级质谱扫描特定范围离子或允扫描特定范围离子或允许特定离子进入碰撞器许特定离子进入碰撞器分离器分离器分子离子碰撞解离分子离子碰撞解离形形成成子离子子
16、离子扫描一定范围子离子选择扫描一定范围子离子选择特定子离子进入检测器特定子离子进入检测器分析仪分析仪第十六页,共四十七页。串联(chunlin)质谱技术设备串联四级杆质谱仪串联四级杆质谱仪进样器进样器高效液相泵高效液相泵仪器控制及数据处理系仪器控制及数据处理系统统第十七页,共四十七页。串联(chunlin)质谱新生儿筛查的基本原理n遗传代谢病:由于遗传因素体内正常代谢途径受阻遗传代谢病:由于遗传因素体内正常代谢途径受阻n氨基酸代谢病患者血中氨基酸水平异常氨基酸代谢病患者血中氨基酸水平异常n有机酸血症及脂肪酸代谢障碍病患者血中游离肉碱或不同种类的酰基肉有机酸血症及脂肪酸代谢障碍病患者血中游离肉碱
17、或不同种类的酰基肉碱水平异常碱水平异常n利用串联质谱仪通过检测利用串联质谱仪通过检测(jin c)(jin c)检测检测(jin c)(jin c)滤纸干血片中氨基滤纸干血片中氨基酸、游离肉碱及酰基肉碱的水平酸、游离肉碱及酰基肉碱的水平n通过一系列规则来评估结果将化合物浓度和代谢疾病关联起通过一系列规则来评估结果将化合物浓度和代谢疾病关联起来,综合判断多种遗传代谢病来,综合判断多种遗传代谢病n一个测试平台上同时检测多个疾病一个测试平台上同时检测多个疾病第十八页,共四十七页。串联(chunlin)质谱新生儿筛查的步骤n采血后滴于专用采血滤纸片,晾干,制成滤纸干血片采血后滴于专用采血滤纸片,晾干,
18、制成滤纸干血片n采用串联质谱技术,通过同位素内标法采用串联质谱技术,通过同位素内标法(IS)(IS)n分析物和对应内标的响应比等比于分析物和对应内标的浓度比分析物和对应内标的响应比等比于分析物和对应内标的浓度比n一次性定量检测一次性定量检测(jin c)(jin c)新生儿的滤纸干血片样品中的数十种氨基酸、酰基肉碱浓度新生儿的滤纸干血片样品中的数十种氨基酸、酰基肉碱浓度n通过一系列规则来评估结果将化合物浓度和代谢疾病关联起来,综合判断通过一系列规则来评估结果将化合物浓度和代谢疾病关联起来,综合判断3030余余种遗传代谢病种遗传代谢病第十九页,共四十七页。衍生(yn shn)化氨基酸扫描质谱图氨
19、基酸氨基酸m/z同位素同位素m/zAla146.0Ala-d4150.3Leu188.1Leu-d3191.2Phe222.2Phe-d5227.2Tyr238.2Tyr-13C6246.2第二十页,共四十七页。串联质谱检测(jin c)指标名称名称缩缩写写丙氨酸丙氨酸 Alanine AlanineAlaAla精氨酸精氨酸 Arginine ArginineArgArg瓜氨酸瓜氨酸 Citrulline CitrullineCitCit鸟鸟氨酸氨酸 Ornithine OrnithineOrnOrn苯丙氨酸苯丙氨酸 Phenylalanine PhenylalaninePhePhe酪氨酸酪氨
20、酸 Tyrosine TyrosineTyrTyr甘氨酸甘氨酸 Glycine GlycineGlyGly亮氨酸亮氨酸 Leucine LeucineLeuLeu甲硫氨酸甲硫氨酸 Methionine MethionineMetMet缬缬氨酸氨酸 Valine ValineValVal脯氨酸脯氨酸 Proline ProlineProPro第二十一页,共四十七页。串联(chunlin)质谱检测指标名称名称缩缩写写名称名称缩缩写写名称名称缩缩写写游离肉碱游离肉碱C CC0C0己己酰酰肉碱肉碱C6C6肉豆肉豆蔻蔻二二烯酰烯酰肉碱肉碱C14:2C14:2乙乙酰酰肉碱肉碱C2C2己二己二酰酰肉碱肉碱C
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