学术讨论—膜蛋白的提取与分离.docx
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1、膜蛋白的提取与分离膜蛋白的分离一、简介:1细胞质膜资料1895年,Overton从研究细胞透性得出细胞膜由连续的脂类物质组成。1925年Gorter&Grendel:用脂单分子膜技术测定细胞膜中脂分子的总面积,提出:细胞膜是由双层脂分子组成。1935年Danielli&Davson:从测定膜的表面张力得出细胞膜的三明治结构模型,即蛋白质脂-蛋白质。1959年Robertson:用电镜观察生物膜提出单位膜模型,将膜的分子结构与超微机构统一起来厚度:2(暗)+3.5(亮)+2(暗)=7.5细胞质膜的主要功能概括如下:(1)为细胞的生命活动提供相对稳定的内环境;(2)选择性的物质运输,包括代谢底物的
2、输入与代谢产物的排除,其中伴随着能量的传递;(3)提供细胞识别位点,并完成细胞内外信息跨膜传递;(4)为多种酶提供结合位点,使酶促反应高效而有序地进行;(5)介导细胞与细胞、细胞与基质之间的连接;质膜参与形成具有不同功能的细胞表面特化结构。2膜蛋白虽动物细胞主要有9种膜脂,而膜蛋白的种类繁多,多数膜蛋白分子数目较少,但却赋予细胞膜非常重要的生物学功能。根据膜蛋白分离的难易及其与脂分子的结合方式,膜蛋白可分为两大类型:外在膜蛋白、内在膜蛋白。(1)外在膜蛋白为水溶性蛋白,靠离子键或其它较弱的键与膜表面的蛋白质分子或脂分子结合,因此只要改变溶液的离子强度甚至提高温度就可以从膜上分离下来,膜结构并不
3、被破坏。(2)内在膜蛋白与膜结合非常紧密,一般讲只有用去垢剂(detergent)使膜解后才可分离出来。获得大量有生物学活性的质膜蛋白对我们显得非常的重要。附注:使用分级抽提方法获得的“膜蛋白”中只有很少一部分是具备多跨膜区的整和膜蛋白,膜蛋白,到目前为止,仍然是蛋白组学的一个瓶颈,不管采用技术也好,乃至proein microarray都还不能有效解决这一问题。二、 蛋白抽提谈及蛋白分离,我们想到:超速离心,盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法有时这些方法常常组合到一起对特定的物质进行分离纯化。由于蛋白质种类繁多,不同的蛋白质由于结构和
4、组成的差异,其溶解度也各不相同.根据蛋白质的溶解特性,同时可选择不同的溶剂提取,分为水溶液提取和有机溶剂提取.但是针对膜蛋白的提取与细胞质蛋白,核蛋白提取不同之处在于它是嵌在膜中的,水溶性不好,基本方法就是用不同的离心速度去掉胞质蛋白等,最后用去污剂把蛋白从膜中释放出来。膜蛋白分离纯化的重要步骤是选择适当的增溶用表面活性剂,一般常用的有胆酸盐,CHAPS(一种离子去污剂),Emulgen和Lubrol等表面活性剂。1、分离膜蛋白的方法(原则性):1)先分离膜,然后提取;如选用冷热交替法、反复冻融法、超声破碎法、玻璃匀浆法、自溶法和酶处理法使得细胞破碎,然后通过剃度离心得到含有膜蛋白的粗组分。(
5、例如:michael11液氮研磨组织,加入匀浆缓冲液及蛋白酶抑制剂。差速离心。蔗糖密度梯度离心。收集37%与41%间的成分,即为质膜部分。裂解即可收集膜蛋白)2)用特殊的去污剂选择性的分离。从膜上提取蛋白有许多困难.在多数情况下,都是采用去垢剂将疏水蛋白从其膜结构中溶解下来,然后将蛋白质稳定.去垢剂的选择通常是依据他对所需要蛋白质的提取效率来确定,但在某些情况下,还要考虑到以后的纯化步骤.虽然许多膜蛋白必须在去垢剂存在的情况下进行纯化,但最终仍可能需要除去去垢剂.这常常会引起蛋白质失活,但如果蛋白质是用于测序的,他将不是一个问题.如果不是用于测序的,可考虑使用能够黏附去垢剂的疏水珠.许多文献和
6、生化试剂供应商的产品目录中,都介绍有许多种不同的可用来溶解膜蛋白的去垢剂.然而,他们并不是普遍适用的.在设计膜蛋白溶解方案时,必须考虑某一去垢剂的特殊性质.如triton X-100在280nm处有吸收,如果某蛋白质的测试与280nm处的吸收有关,就应避免使用这类去垢剂.将膜制剂与胞质蛋白及细胞核分离后,再进一步从细胞膜制剂中将所需的膜蛋白增溶下来.这种做法的好处是可以用强烈的去垢剂提取细胞骨架的相关蛋白,而无需考虑胞质蛋白、细胞核成分或染色质成分的混入.使用这种方法所获得的膜蛋白,无论在种类上还是数量上,都比酸溶解法所得到的蛋白(5000Da)要多.一般提取的膜蛋白量往往只占膜蛋白总量的不足
7、0.1%,所以充分的膜蛋白的提取,无疑对于研究膜蛋白的结构和功能都是非常重要的.第二种方法简单,可靠,但有时含有其他蛋白。一般的都是利用4度时所有的蛋白质原则上都溶于TritonX114水溶液,在温度超过20度时,此溶液分为水相和去污相;此时亲水性蛋白溶于水相,疏水的膜蛋白溶于去污剂相中。利用此性质可提取膜蛋白。3 )膜蛋白色谱(Chromatography of Membrane Protein,CMP)CMP+分离强疏水性蛋白、多肽混合物的层析系统,一般有去垢剂(如SDS)溶解膜蛋白后形成SDS-融膜蛋白,并由羟基磷灰石为固定相的柱子分离纯化。羟基磷灰石柱具有阴离子磷酸基团(P-端),又具
8、有阳离子钙(C-端),与固定相结合主要决定于膜蛋白的大小、SDS结合量有关。利用原子散射法研究cAMP的分离机制发现,样品与SDS结合后在离子交换柱上存在SDS分子、带电荷氨基酸与固定相中带电离子间的交换,从而达到分级分离的目的。层析柱提取(参步骤)三、 4)顺序抽提法:根据细胞蛋白溶解性的差异,用具有不同溶解能力的蛋白溶解液进行抽提的方法。用Tris碱溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白;把未溶解的pellet用标准液溶解提取高疏水性蛋白;最后用含复合表面活性剂的蛋白溶解液,最后可以再次抽提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白。5)centrifugal protein extraction. 离心的原理:
9、高渗的蛋白裂解液让细胞溶涨破裂后,超高速离心评价:尽管分级(胞浆和胞膜)之间有清洗的步骤,但是可溶蛋白组分和膜蛋白组分之间仍然有不少重复的点.该方法相较MOLLOY MP教授在1998年electrophoresis上发表的分级抽提法减去了第一步(用tris抽提水溶性蛋白)和最后一步(极难溶蛋白),在操作上也作了简化,总而言之是一种不错的方法。(codegreen)6)detergent- based:提取时先裂解液裂胞膜(选用不同的去污试剂是关键),梯度离心分离细胞器(ER),然后分级抽提方法。例如,去掉细胞器之后的DEBRIS就是核膜,再裂解得到核膜蛋白。而膜蛋白是裂胞膜时不溶的部分。总的
10、感受:细胞的量要很充足。之后的定性鉴定常用的方法有双向免疫扩散、免疫电泳及聚丙稀酰胺凝胶电泳等。纯化蛋白质浓度的定量测定可用双缩脲法、酚试剂法或紫外光吸收法定量鉴定膜蛋白,方便迅速。到目前为止,提取膜蛋白仍然是蛋白学的一个瓶颈。2、分离膜蛋白的方法(操作)1)分离细胞膜蛋白的方法:1冰上刮下细胞后将细胞溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液A中,于室温与液氮罐中反复冻融2次。2 5000转4度离心,驱除核及未裂解的细胞。3取上清12000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液B中。4 12000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液C中提取后测蛋白浓度,SDS-PAGE电泳,分装后
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