DB21_T 3785—2023牛羊布鲁氏菌病荧光偏振(FPA)检测技术规程-(高清版).pdf
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1、ICS11.220CCS B 4121辽宁省地方标准DB21/T 37852023牛羊布鲁氏菌病荧光偏振(FPA)检测技术规程Detection of brucellosis in cattle and sheep by Fluorescence PolarizationAssay(FPA)2023-07-30 发布2023-08-30 实施辽宁省市场监督管理局发 布DB21/T 37852023I目次前言.II1范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14缩略语.15生物安全要求.16技术原理.17设备试剂与材料.28样品采集和处理.29操作前准备工作.210试验操作.2附录 A(规范性)
2、试剂配制.5DB21/T 37852023II前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由辽宁省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位:辽宁省农业发展服务中心、锦州市疾病预防控制中心、哈尔滨平河生物技术有限公司、辽宁中科基因技术有限公司。本文件主要起草人:张雅为、于本良、顾贵波、兰德松、朱江巍、王克才、陈瑶、段亚良、李井春、孙世宇、魏澍、张辉、刘坤洋、刘佳、白梅、张旭、李泽钦、张祎。本文件发布实施后,任何单位和个人如有问题和意见建议,均可以通过来电和来函等方式
3、进行反馈,我们将及时答复并认真处理,根据实际情况依法进行评估及复审。归口管理部门通讯地址:辽宁省农业农村厅(沈阳市和平区太原北街2号),联系电话:024-23447862。文件起草单位通讯地址:辽宁省农业发展服务中心(沈阳市沈北新区人和街95号),联系电话:024-88420057。DB21/T 378520231牛羊布鲁氏菌病荧光偏振(FPA)检测技术规程1范围本文件规定了牛、羊布鲁氏菌病荧光偏振(FPA)检测的生物安全要求、技术原理、设备试剂与材料、样品采集和处理、操作前准备、试验操作等技术内容。本文件适用于牛、羊布鲁氏菌抗体水平的初筛检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性
4、引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB 19489实验室 生物安全通用要求NY/T 541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范NY/T 1948兽医实验室生物安全要求通则3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4缩略语下列缩略语适用于本文件。FPA:荧光偏振检测(Fluorescence Polarization Assay)mP:荧光偏振值(Millipolarisation Units)OPS:O-多糖(O-Polysaccharide)DEAE:二乙氨基乙基葡聚糖FI
5、TC:荧光素异硫氰酸酯5生物安全要求为了保护实验室检测人员的安全,实验操作应在相应级别的生物安全实验室内进行,严格按照 GB19489 和 NY/T 1948 要求执行。6技术原理溶液中的分子作随机转动,分子的大小是影响转动速率的主要因素,与其成反比关系,因而小分子较大分子转动得快。如果给分子标记上荧光色素,通过68.5角度的转动时间,可以通过测量水平和垂直的偏振光强度来确定。DB21/T 378520232诊断布鲁氏菌病时,采用牛种布鲁氏菌LPS的小分子量片段(平均22KD),标记荧光素异硫氰酸酯(FITC)作为抗原,被检血清中若有抗体存在,与标记抗原结合后就会降低其转动速度,使用荧光偏振分
6、析仪测定出偏振值,通过偏振值判断样品的阴、阳性。7设备试剂与材料设备荧光偏振检测仪(试管型便携式FPA仪、台式FPA分析仪)、微量移液器(1 L10 L、20 L200L、100 L1000 L)、多道移液器(10 L200 L)、旋涡振荡器。试剂标准阳性血清(布鲁氏菌病荧光偏振商品化试剂)、标准阴性血清(布鲁氏菌病荧光偏振商品化试剂)、FPA标记抗原(布鲁氏菌病荧光偏振商品化试剂或自行配置试剂,配置方法见附录A.1)、FPA样品稀释液(布鲁氏菌病荧光偏振商品化试剂或自行配置试剂,配置方法见附录A.2)、氯化钠、Tris、Tween-20、EDTA。材料10 mm75 mm硼硅玻璃试管(试管应
7、清洁无指纹等,且无刮痕)、96孔黑色平底微量板、吸头(10L、200 L、1000 L)。8样品采集和处理按照NY/T 541中的方法采集和分离受检牛、羊的血清,分离后的血清应清亮透明没有溶血现象和腐败现象,血清量通常为 1 mL备用。9操作前准备工作将试剂和样品恢复至室温(18 26),检测操作应在室温(18 26)下进行。10试验操作试管法检测10.1.1仪器校准10.1.1.1每天第 1 次试验前或 FPA 检测仪被移动后,都要检测对照血清。10.1.1.2在两个 10 mm75 mm 硼硅玻璃试管中分别加入 1 mL 的 FPA 样品稀释液。10.1.1.3在两个试管中分别加入 10
8、L 的阳性和阴性对照血清,充分混合均匀(旋涡混合器振动 5s)。10.1.1.4使用试管型便携式 FPA 仪分别读取两管的空白密度值。10.1.1.5每管加入 10 L 的 FPA 标记抗原,充分混合均匀(旋涡混合器振动 5s)。10.1.1.6孵育至少 2min,最长不超过 5min。10.1.1.7使用便携式 FPA 仪读取两管的 mP 值。试管的检测顺序与读取空白密度值时的顺序一致。DB21/T 37852023310.1.1.8对照结果:阴性对照牛血清的 mP 值低于 90 mP(通常在 75 mP 左右);阳性对照血清的 mP值在 200 mP 左右,则对照成立,可以进行样品检测。否
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