(高清正版)DB37_T 3997-2020 细菌耐药基因blaNDM常见亚型的环介导等温扩增检测技术.pdf
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1、ICS 11.220 B 41 DB37 山东省地方标准 DB37/T 39972020 细菌耐药基因blaNDM常见亚型的环介导等温扩增检测技术 Loop-mediated isothermal amplification detection technique for common subtypes of bacterial resistance gene blaNDM 2020-06-08 发布 2020-07-08 实施 山东省市场监督管理局 发 布 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归
2、口。本标准主要起草单位:山东省农业科学院畜牧兽医研究所、山东润达检测技术有限公司。本标准主要起草人:齐静、刘玉庆、杜以军、李璐璐、胡明、骆延波、张庆、张印、赵效南、任金瑞、刘军伟、王怀中、陶海英。细菌耐药基因blaNDM常见亚型的环介导等温扩增检测技术 1 范围 本标准规定了细菌耐药基因blaNDM常见亚型(blaNDM-1、blaNDM-4、blaNDM-5和blaNDM-9)的环介导等温扩增LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification)检测技术的操作步骤。本标准适用于实验室及临床样本的细菌耐药基因blaNDM常见亚型(blaNDM-1、blaNDM
3、-4、blaNDM-5和blaNDM-9)的快速可视化检测,其他几个亚型的检测可以参考使用。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 16489 水质 硫化物的测定 亚甲基蓝分光光度法 3 试验原理 本标准所应用的试验原理为:根据序列保守区域设计一对外引物、一对内引物和一对环引物特异性识别靶序列上六个独立区域,在Bst DNA聚合酶的作用下引起自循环链置换反应,大量合成目标DNA的同时伴随有副产物焦磷
4、酸镁白色沉淀产生,可以实现恒温扩增和快速检测,结果通过肉眼即可判定。4 试剂或材料 除非特别规定所用试剂均用分析纯水:符合国标GB/T 6682一级水的规定。4.1 Bst DNA 聚合酶。4.2 0.5TBE 缓冲液:配制见附录 A.2。4.3 2%琼脂糖电泳液:配制见附录 A.3。4.4 无毒核酸染料。4.5 DNA Marker 2000。4.6 商品化的细菌基因组 DNA 提取试剂盒。4.7 引物:blaNDM基因几个国内常见亚型的 LAMP 检测引物如下:外引物 F3:5-GGCCACACCAGTGACAAT-3;外引物 B3:5-GCGGAATGGTCATCACGAT-3;内引物
5、FIP:5-ACTTGGCCTTGCTGTCCTTGATGTTGGGATCGACGGCAC-3;内引物 BIP:5-CGCTCGGCAATCTCGGTGATGCTGGCCTTGGGGAACGC-3;环引物 LF:5-GCTGTAGCGAAAACCACCG-3;环引物 LB:5-ACACTGAGCACTACGCCG-3。5 仪器设备 5.1 微量移液器:10 L、20 L、100 L、1 000 L。5.2 低温高速离心机:离心力 20 000 g。5.3 电热恒温水浴锅。5.4 稳流稳压电泳仪。5.5 水平电泳槽。5.6 凝胶成像系统。5.7 电子分析天平:精度 0.001 g。6 试验步骤
6、6.1 样品 在生物安全柜中,将采集的样品(如人或动物的肛拭子、鼻拭子或肝脏、脾脏、脑等不同脏器组织等)无菌划线特异性筛选培养基或哥伦比亚血琼脂培养基,置37 培养箱过夜培养12 h18 h,获得细菌单菌落,经二次纯化后,挑取单菌落于BHI营养肉汤中过夜培养12 h18 h,用于提取细菌基因组DNA。6.2 DNA 的提取 收集过夜培养的待检细菌菌液1 mL(菌液浓度的OD600值大于1.0)到1.5 mL的EP管中,12 000 g离心2 min,彻底弃上清,取沉淀用商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组总DNA,最后溶于50 L灭菌水中,测定DNA的浓度,-20 保存备用。6.3
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