DB37_T 4101-2020 苹果轮纹病菌快速检测方法.pdf
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1、 ICS 65.020.20 B 16 DB37 山东省地方标准 DB37/T 41012020 苹果轮纹病菌快速检测方法 Rapid detection of botryosphaeria dothidea 2020-08-31 发布 2020-10-01 实施 山东省市场监督管理局 发 布 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由山东省农业农村厅提出并组织实施。本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位:山东省烟台市农业科学研究院。本标准主要起草人:王英姿、刘保友、汪少丽、王培松、石洁。苹果轮纹病菌快速检测方法 1 范围 本标准规定了用环介导等温扩增(
2、LAMP)快速检测苹果轮纹病菌的测定方法。本标准适用于苹果叶片、枝条和果实中苹果轮纹病菌的快速检测。方法检出限:10-7ng/L苹果轮纹病菌DNA。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 原理 3.1 扩增原理 根据苹果轮纹病菌的ITS序列中特异性序列设计特异性内、外引物及环引物各一对,特异性序列参见附录A。三对引物特异性识别靶标序列上的六个独
3、立区域,利用Bst酶启动循环链置换反应,在ITS基因序列启动互补链合成,在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物,加入显色液即可通过颜色变化观察判定结果。3.2 显色液显色原理 SYBR Green I是一种高灵敏度的DNA荧光染料,可以嵌入方式结合到双链DNA的小沟内。当它与双链DNA结合时,荧光信号是游离状态的8001 000倍。在不发生扩增反应时,SYBR染料分子的荧光信号不发生改变,颜色显现为橙色;当发生扩增反应时,随着双链DNA的增加,SYBR染料的荧光信号也随之大幅度增强,其信号强度可代表双链DNA分子的数量,同时颜色由橙色变为绿色。4 缩略语 下列缩
4、略语适用于本文件。LAMP:环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification)DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)ITS:内转录间隔区(Internal transcribed spacer)2Lamp Master Mix:等温扩增PCR混合液 Bst酶:Bst DNA 聚合酶(Bst DNA polymerase)5 试剂和材料 除有特殊说明外,所有实验用试剂均为分析纯;实验用水为GB/T 6682中规定的一级水。5.1 等温扩增 PCR 混合液(2Lamp PCR Master Mix1)):包含 40 mmol/
5、L Tris-HCl、20 mmol/L(NH4)2SO4、20 mmol/L KC1(pH 值为 8.8)、16 mmol/L MgSO4、2.0 mmol/L dNTPs、0.2%Trion X-100。5.2 Bst DNA 聚合酶:酶浓度 8 U/L。5.3 显色液:SYBR Green I 荧光染料,1 000。5.4 引物:根据苹果轮纹病菌 ITS 基因序列设计一套特异性引物,包括外引物 1(F3),外引物 2(B3),内引物 1(FIP),内引物 2(BIP),环引物 1(LF)和环引物 2(LB)。外引物扩增片段长度:189 bp,引物序列见附录 A。5.5 DNA 快速提取液
6、:DNA-EZ Reagents All-DNA-Fast-Out2)。5.6 甜菜碱:5 mol/L。5.7 离心管:0.1 mL、1.5 mL。5.8 塑料研磨棒:长度 70 mm,研磨头外径 6.2 mm,研磨头长度 9.5 mm。6 仪器设备 6.1 恒温箱:满足 65 3、80 1 要求。6.2 移液器:量程 0.5 L10 L,量程 10 L100 L,量程 100 L1 000 L。7 测定步骤 7.1 试验设置 7.1.1 阴性对照:采用不含有目标基因序列的苹果腐烂病菌(Valsa mali)基因组 DNA 为模板。7.1.2 阳性对照:采用含有目标基因序列的苹果轮纹病菌(Bo
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