DB32_T 2957-2016鲤疱疹病毒Ⅱ型PCR检测方法—(高清现行).pdf
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1、ICS 65.150 B50 备案号:51404-2016 DB32 江苏省地方标准 DB32/T 2957-2016 鲤疱疹病毒型 PCR 检测方法 PCR inspection specification of cyprinid herpesvirus 2016-09-20 发布 2016-11-20 实施 江苏省质量技术监督局 发 布 前 言 本标准按GB/T1.12009标准化工作导则第1部分:标准的结构和编写规则要求进行编写。本标准由江苏省海洋与渔业局提出。本标准起草单位:江苏省水生动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人:陈辉、袁锐、方苹、倪金俤、刘训猛、陈静、郭立新、吴亚锋 鲤疱疹
2、病毒型 PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了鲤疱疹病毒型(cyprinid herpesvirus)检测方法的试剂和材料、仪器和设备、采样、检测步骤和结果判断。本标准适用于鲫鱼疱疹病毒病病原的检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682-2008分析实验室用水规格和试验方法 SC/T 7014-2008 水生动物产地检疫采样技术规范 3 试剂和材料 3.1 水 符合 GB/T 6682-2008 中一级水的规格。(该水用来配置规范性附录
3、 A 中所列试剂)3.2 无水乙醇 3.3 十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)3.4 Taq DNA 聚合酶及配套的 10 PCR 缓冲液 Taq DNA 聚合酶或 Ex Taq DNA 聚合酶,生化试剂,-20保存。10 PCR 缓冲液为该酶配套的相应反应缓冲液,生化试剂,-20保存。3.5 MgCl2(25mmol/L):生化试剂,-20保存。3.6 dNTPs 混合物 含 dATP、dTTP、dCTP、dGTP 各 10mmol/L 的混合物,-20保存。3.7 5 TBE 电泳缓冲液(按附录 A 的规定)。3.8 6 DNA 上样缓冲液(按附录 A 的规定)。3.9 引物及扩增片段 鲤疱
4、疹病毒型 DNA 聚合酶基因扩增引物:P1:5-CCCAGCAACATGTGCGACGG-3,P2:5-CCGTARTGAGAGTTGGCGCA-3。扩增片段大小为 362 bp。注:该引物为扩增鲤疱疹病毒型 DNA 聚合酶基因的通用引物。3.10 DNA 分子量标准 宜使用 DNA marker 2000,各片段大小依次为:2000 bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp,也可使用其他合适的 DNA 分子量标准。3.11 阳性对照 阳性对照为已知受鲤疱疹病毒型感染,且 PCR 检测结果为鲤疱疹病毒型阳性并经测序验证的DNA 模板,-20保存。3.12 阴性对照好
5、阴性对照为已知未受鲤疱疹病毒型感染,且 PCR 检测结果为鲤疱疹病毒型阴性的组织,提取DNA,-20保存。3.13 空白对照 灭菌双蒸水(无 DNA 酶)。3.14 核酸染色剂 Goldview TM核酸染料或其他宜使用的核酸染料。4 仪器和设备 4.1 台式高速离心机:最高转速可达 12000 rpm 以上。4.2 普通冰箱:具有冷藏箱,-20以下冷冻箱体。4.3 PCR 仪。4.4 电泳仪:输出直流电压 0-600V。4.5 水平电泳槽。4.6 凝胶成像仪。4.7 水浴锅或者金属浴。5 采样 5.1 采样数量 按 SC/T 7014-2008 中 6.1 的规定执行。5.2 个体要求 活鱼
6、或濒死的鱼。5.3 采样部位 有临床症状的鱼,如体长不超过 4 cm,取鳃;体长为 4 cm6 cm,取鳃和内脏(包括肾);体长大于 6cm,则取脑、肝、肾、脾和鳃组织。无症状的鱼取肾、脾、鳃和脑组织。性成熟雌鱼还需取卵巢液。5.4 操作要求 5.4.1 采样及样品前处理过程中应戴一次性手套,样本间不得交叉污染。5.4.2 镊子,剪刀等取样工具需要进行灭菌(湿热灭菌为 121,20 min;干燥灭菌为 160,3 小时)。5.4.3 实验室以外的环境下采得的组织样品需用液氮及时保存。6 检测步骤 6.1 DNA 抽提 6.1.1 取 100 mg 左右待检新鲜组织与 300 L CTAB 溶液
7、研磨匀浆,置于 1.5 mL离心管内。加入 450 uL CTAB 溶液并混匀,65放置 2 h。6.1.2 加入 600 L 酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)至样品离心管中,持续上下颠倒用力混合至少 1 min,12000 r/min 4离心 10min,小心取上层水相(约 700 L)置于新的 1.5 mL 离心管中。6.1.3 加入 700 L 氯仿-异戊醇(24:1),用力混合至少 30 s,12000 r/min 4离心 5 min,小心取上层水相(约 600 L)置于新的 1.5 mL 离心管中。6.1.4 加入-20预冷的 1.5 倍体积无水乙醇(约 900 L),倒转数次混匀
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