YY_T 0870.1-2013 医疗器械遗传毒性试验 第1部分:细菌回复突变试验.pdf
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1、1 5 1 1.0 4 0.0 1C 3 0中 华 人 民 共 和 国 医 药 行 业 标 准YY/T 0 8 7 0.1 一2 0 1 3 医疗器械遗传毒性试验第 1 部分:细菌回复突变试验T e s t for g e n o t o x i c i t y o f me d i c a l d e v i c e s 一 P a r tl:Ba c t e r i a l r e v e r s e mu t a t i o n t e s t2 0 1 3 一 1 0 一 2 1 发布2 0 1 4 一 1 0 一 0 1 实施臀 、刮 涂 甩 宜 要 伪.产 产,尸国家食品药品监督管
2、理总局发 布Y Y/T 0 8 7 0.1 一2 0 1 3.JJ 臼 J一月U吕 Y Y/To 8 70 的总标题是 医疗器械遗传毒性试验,包括以下部分:第 1 部分:细菌回复突变试验;第 2 部分:体外哺乳动物细胞染色体畸变试验;第 3 部分:用小鼠淋巴瘤细胞进行的体外哺乳动物细胞基因突变试验;第 4 部分:哺乳动物骨髓红细胞微核试验;第 5 部分:哺乳动物骨髓染色体畸变试验。有关其他方面的遗传毒性试验将有其他部分的标准。本部分为 Y Y/T 0 8 7。的第 1 部分。本部分按照 G B/TI.1 一2。9给出的规则起草。Y Y/T 0 8 70的 本部分是参考O E c D4 71一1
3、 9 9 7 细 菌回 复突变试验 并结合医疗器械/材料自 身特点制定的。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家食品药品监督管理总局提出。本部分由全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会(S A C/TC 2 4 8)归口。本部分主要起草单位:国家食品药品监督管理局济南医疗器械质量监督检验中心。本部分参加起草单位:国家食品药品监督管理局天津医疗器械质量监督检验中心、国家食品药品监督管理局北京医疗器械质量监督检验中心。本部分主要起草人:曾冬明、黄经春、于兆琴、陶剑、汤菊莉。Y Y/T 0 8 7 0.1 一2 0 1 3引言 G B/T16886
4、.3中给出的检测潜在遗传毒性物质的试验方法均为经济合作与发展组织(O E C D)化学品测试指南 中规定的方法,但这些方法是针对化学品的特性制定而成,同时未给出详细的试验步骤,因此不适宜直接用于医疗器械/材料的检测。Y Y/T 0 8 7。参照 O E C D试验方法基本原则,并根据医疗器械/材料的特性对试验方法进行了适当的修改,规定了详细的试验步骤,可作为 G B/T1 6 8 86.3中遗传毒性试验的补充方法标准。Y Y/To 8 7。的本部分参照 O E C DNo.4 7 1(1 9 9 7)方法,有或无代谢活化系统的情况下,通过观察医疗器械/材料诱导组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌株(
5、h 1 5-)和色氨酸营养缺陷型大肠杆菌菌株的突变情况,以评价其潜在的致突变性。点突变是许多人类遗传性疾病的原因。有确切的证据表明,体细胞的癌基因和肿瘤抑制基因的点突变与人类和实验动物的肿瘤形成有关。许多试验菌株因具有多种特性,如回复位点的D NA序列、细胞对大分子通透性的增加、D N A修复系统的缺失或 D N A修复过程中错配的提高等,而使得它们对突变的检测更为敏感。其中,细菌回复突变试验具有快捷、廉价并且相对容易操作等优点,可用来检测D N A碱基对的替代、增加或缺失,为遗传毒性物质诱导的突变类型提供有用的信息。YY/T 0 8 7 01 一2 0 1 3 医疗器械遗传毒性试验第 1 部
6、分:细菌 回复突变试验范围Y Y/TO 8 7 0的本部分规定了医疗器械/材料细菌回复突变试验方法。本部分推荐使用平板掺人法。注:口腔材料的A me s 试验见YY/T 0 1 2 7.1 0。规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。G B/T 16886.1 医疗器械生物学评价第 1 部分:风险管理过程中的评价与试验 G B/T 168 8 6.3 医疗器械生物学评价第3 部分:遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验 G B/T16886.12医疗器械生物学评价第 12
7、 部分:样品制备与参照样品术语和定义G B/T 1 6 8 8 6.1、G B/T 1 6 8 8 6.3 和 G B/T 1 6 8 8 6.1 2界定的术语和定义适用于本文件。主要设备 生物安全柜、电热干燥箱、恒温培养箱、恒温水浴箱、恒温振荡水浴箱、压力蒸汽灭菌器、低温高速离心机、低温冰箱(一80)或液氮罐、匀浆器、菌落计数仪和电子天平等。5 活 化系统、培养基和试剂试验用活化系统(59 和 59 混合液)、培养基和试剂按附录 A和附录 B的规定制备或购买市售产品。6 菌株及 其鉴定和保存6.1 菌株本部分宜至少采用4 株鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株进行试验,推荐的菌株组合为:a)鼠伤寒沙门氏
8、菌株 T A 1 5 3 7 或 T A 97 或 T A 9 7 a;b)鼠伤寒沙门氏菌株 T A 98;c)鼠伤寒沙门氏菌株 T A 1 0 O;d)大肠杆菌 WP Z u v r A,或WP Z u v r A(p K Ml o l),或鼠伤寒沙门氏菌株T Al o Z;e)鼠 伤寒沙门氏 菌株T A 1 5 3 5(可 供选择)。注:为了检测交联突变剂,所选菌株中最好包括 T A1 02 或增加一种 D NA易修复的大肠杆菌株(如 WP Z或WP Z (p KM 1 0 1)。YY/T 0 8 7 0.1 一2 0 1 36.2 菌株特性 菌株特性应与表1 相符。突变型菌株的某些特性容
9、易丢失或变异,在下列情况下,应进行菌株基因型的鉴定并形成文件:a)在收到培养菌株后;b)当制备一套新的冷冻保存或冰冻千燥菌株时;c)当每皿自发回变数不在正常范围时;d)当对诱变剂丧失敏感性时;e)使用主平板传代时;f)投人使用前。菌株鉴定结果基 因型菌 株 脂多糖屏 障 缺 失“R 因 子(抗 氨 节 青 霉 素)抗 四 环,一修 巍自发 回 变菌 落数 fTA 9 7T A9 8TA 1 0 09 0 1 8 0悬斗一+丁A I O Z 32 0TA 1 5 3 5 3 5 T A1 5 3 7W P Z(p K M I O I骥+-+-+-+“十”表示霭、“+”表示有组钊创 带“+”表示具
10、有月“+”表示有四环子,瓦 性“+,表 示 无 修 复 能 力、该数值为参考值,可在验础 卜室 的 规 定 数6.3菌株鉴定6.3.1 增菌培 养 在 sm L营养肉汤培养基中接种贮存菌培养物,于(37士2)条件下振荡(1 1 5r/m in一1 25 r/mi n)培养 l oh 一1 2h。6.3.2组氨酸缺 陷型的鉴定63.2.1 加热融化底层培养基两瓶(一瓶不加组氨酸,一瓶加组氨酸),不加组氨酸者每 1 00 mL底层培养基中加。.5 mmol仆生物素0.6mL;加组氨酸者每 1 00 m L底层培养基中加L-组氨酸 lmL(每100 m L中 含。.4 04 3 9)和。.5 m m
11、 ol仆生物素。.6 m L,冷却至50左右,各倒两个平皿。2Y Y/T0 8 7 0.1 一2 0 1 36.3.2.2 接种:取有组氨酸和无组氨酸培养基平皿各一个,按菌株号顺序各取一白金耳菌液划线(直线)接种在培养基表面,37 培养48 ho6.3.2.3 结果判定:受试菌株在有组氨酸培养基平皿表面各长出一条菌膜,无组氨酸培养基平皿上除自发回复突变菌落外无菌膜,说明受试菌株确为组氨酸缺陷型。6.3.3 月 旨多糖屏障缺 陷的鉴定6.3.3.1 接种:取菌液 0.1 mL移人平皿,迅速将加热融化的营养肉汤琼脂培养基(冷却至 50 左右)适量倒人平皿,混匀,平放凝固。将一片无菌滤纸片放人已凝固
12、的培养基平皿中央,用移液器在滤纸片上滴加。.1%结晶紫溶液10 尸 L,37培养24 h,每个菌株做一个平皿。6.3.3.2 结果判定:阳性者在纸片周围出现一个透明的抑制带,说明存在rfa(深粗型)突变。T A 97、T A9 8、T A1 0 0、T A 1 5 3 5、T A1 5 3 7、T A 1 0 2和 WP Z(p K M1 0 1)均有抑制带,野生型鼠伤寒沙门氏菌和野生型WP Z(p K M1 0 1)没有抑制带。6.3.4R因子的鉴定6.3.4.1 加热融化营养肉汤琼脂培养基,冷却至50 左右,适量倒人平皿中,平放凝 固,用移液器吸。.8%氨 节青霉素10胖 L,在 凝固的培
13、养基 表面 依中 线涂 成一条带,待氨节青霉素溶液干后,用接种环与氨节青霉素带相交叉划线接种要鉴定的菌株,并且接种一个不具有 R因子的菌株作氨节青霉素抗性的对照(一个平皿可同时鉴定几个菌株),37 培养 24 ha6.3.4.2 结果判定:菌株经过 24 h培养,在氨节青霉素带的周围依然生长不受抑制,即有抗氨节青霉素效应,证 明带有 R因子。6.3.5 uvr B修复缺陷型的鉴定6.3.5.1 在营养肉汤琼脂培养基平皿表面用接种环划线接种需要的菌株。接种后的平皿一半用黑纸覆盖,在距 15W紫外线灭菌灯33 c m处照射8 5,37 培养24 h。63.5.2 结果判定:对紫外线敏感的菌株仅在没
14、有照射过的部分生长。6.3.6四环 素抗性的鉴定6.3.6.1 用移液器各吸取 5拌 L 一10“L 0.8%的四环素溶液和。.8%的氨苇青霉素溶液,在营养肉汤琼脂培养基平皿表面依中线各涂成一条带,待四环素和氨节青霉素液干后,用接种环于四环素和氨节青霉素带相交叉划线接种T A1 02 和一种有 R因子的菌株(作为四环素抗性的对照),37 培养 24 h。6.3.6.2 结果判定:T A 1 02 菌株生长不受抑制,对照菌株有一段生长抑制区,表明T A102 菌株有抗四环素效 应。6.3.7自发 回变菌落数的鉴定6.3.7.1 每株菌准备底层培养基平皿 2 个,同时融化顶层培养基 2 管,每管
15、Z mL,在 45 水浴中保温。6.3.7.2 在每管顶层培养基中,分别加人待鉴定的试验菌株的菌液0 1 mL,各 2 管,轻轻摇匀,迅速将此试管的内容物倾人已固化的底层培养基平皿中,转动平皿,使顶层培养基均匀分布,平放固化,37 培养 48 h计数菌落数,计算平均自发回变菌落数。6.3.7.3 结果判定:每一菌株的平均自发回变菌落数应落在表 1 所列正常范围内。6.4菌株保存鉴定合格的菌种应加人冷冻保护剂(例如光谱级二甲基亚矾(D MS O)或甘油),保存在深低温 3Y Y/T 0 8 7 0.1 一2 0 1 3(如一80)或液氮中,或者冰冻干燥制成干粉,4保存。除液氮条件外,保存期一般不
16、超过 2 年。主平板贮存在4,超过两月后丢弃,T A 1 02主平板保存两周后应该丢弃。7 试验前准备7.1 器具灭菌 与试验和对照样品接触的所有器具应采用可靠方法灭菌,置压力蒸汽灭菌器内 1 21 30 min,或置电热干燥箱内1 60 Zh。7.2试验环境要求试验应在生物安全柜中进行。样品制备 根据 GB/T16怀疑试验样 品可有 目引 京贝 制备试验液。可采用生理盐水和/或其他适株产生抑制作用时,应进行预试验。齐 啊 为浸提介质。如全 乡 走p 试验洋,提 供行、反 的验,可 考 虑 单 持 性 数 据。化验注 1:1 5 0 1 0 9注2:与经;剂 量 生9对照样品翻备9.1 阴性对
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