LY∕T 3107-2019 柳树品种微卫星标记鉴别技术规程.pdf
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1、ICS 65.020.20 B 61 LY 中 华 人 民 共 和 国 林 业 行 业 标 准 LY/T 31072019 柳树品种微卫星标记鉴别技术规程 Technical regulation for willow varieties identification by SSR markers (发布稿)2019-10-23 发布 2020-04-01 实施 国家林业和草原局 发 布 LY/T 31072019 I 前 言 本标准按照GB/T1.12009标准化工作导则 第1部分:标准的结构和编写给出的规则起草。本标准由全国林木种子标准化技术委员会(SAC/TC 115)提出并归口。本标准
2、主要起草单位:南京林业大学。本标准参加起草单位:江苏省林业科学研究院;山东省林业科学研究院。本标准主要起草人:李淑娴、戴晓港、尹佟明、陈赢男、刘德玺、何旭东。LY/T 31072019 1 柳树品种微卫星标记鉴别技术规程 范围范围 本标准规定了以柳属(Salix)植物 DNA 为材料,利用微卫星标记(microsatellite)对国家和省审(认)定的柳树品种进行分子鉴定的规范化操作技术。本标准适用于附录 A 中所列柳树品种的鉴别。2 术语和定义术语和定义 2.1 微卫星微卫星标记标记 microsatellite 微卫星标记,又被称为短串联重复序列(short tandem repeats,
3、STRs)或简单重复序列(simple sequence repeats,简称 SSR),是指基因组中由 26 个核苷酸组成的 DNA 串联重复序列。2.2 基因型频率基因型频率 genotype frequency 基因型频率指不同基因型在全部个体中所占的比率,全部基因型频率的总和为 1 或 100%。3 操作程序操作程序 3.1 取样取样和保存和保存 取柳树幼嫩叶片 5 片10 片,用干燥硅胶密封保存,用于 DNA 提取。3.2 DNA 提取所需试剂提取所需试剂 a)1 M Tris:称取 12.11 g Tris 溶解到 80 mL 超纯水中,调节 pH=8.0,定容到 100 mL。b
4、)0.5 M EDTA:称取 18.61 g EDTA 溶解到 80 mL 超纯水中,调节 pH=8.0,定容到 100 mL。c)5 M 氯化钠:称取 23.38 g 氯化钠溶解到 80 mL 超纯水中,定容到 100 mL。d)5 M 醋酸钾:称取 25.54 g 醋酸钾,200 mL 超纯水溶解后定容到 250 mL。e)2%SDS:称取 1.0 g 十二烷基硫酸钠(SDS),40 mL 超纯水溶解后定容到 50 mL。f)10%CTAB:称取 10 g CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)溶解到 80 mL 超纯水中,定容 到 100 mL。g)氯仿异戊醇:240 mL 氯仿,10 mL
5、异戊醇混合。h)70%乙醇:70 mL 乙醇,加入 30 mL 超纯水。i)CTAB 裂解液:1 mL 1 M Tris(pH=8.0),4 mL 0.5 M EDTA(pH=8.0),28 mL 5 M 氯化钠,10 mL 10%CTAB,5 g 聚乙烯吡咯烷酮,定容到 100 mL。j)TBE 缓冲液(10):称取 108 g Tris 碱和 55 g 硼酸,加入 40 mL 0.5 M EDTA 溶液(pH=8.0),用LY/T 31072019 2 800 mL 双蒸水溶解后定容到 1 L,高温灭菌。3.3 DNA 提取提取 DNA 提取采用改良的 CTAB 法:a)向 2 mL 离心
6、管中加入 400 L CTAB 裂解液,10 L 的 10 mg/mL Rnase,2 L-巯基乙醇。b)取柳树叶片 3-5 片,放入研钵中加入液氮充分研磨,将研磨后的样品转入 3.2.1 的离 心管中,涡旋混匀后,65保温 10 min,再加入 400 L 2%SDS,涡旋混匀,65保温 10 min。c)向 3.2.2 的离心管中加入 130 L 5 M 醋酸钾,涡旋混匀,将离心管插入冰中保存 10 min。d)加入 800 L 氯仿异戊醇溶液(氯仿:异戊醇=24:1),涡旋混匀后,12000 rpm 离心 5 min。e)将上清液转移到新的 2 mL 离心管中,加入等体积预冷的异丙醇,颠
7、倒离心管 8-10 次,-20冻存 20 min。f)取出离心管,12000 rpm 离心 5 min,去除上清液。g)加入 500 L 的 70%乙醇,12000 rpm 离心 2 min,去除上清液。h)重复 3.2.7 步骤一次。i)加入 500 L 无水乙醇,12000 rpm 离心 5 min,去除上清液,离心管开盖室温放置 30 min。j)加入 100 L TE 缓冲液,37保存 5 min,涡旋混匀获得 DNA,将样品放在-80 长期保存。3.4 DNA 定量定量及质量检测及质量检测 a)取 2 L DNA 用微量核酸蛋白检测仪检测,直接读出 DNA 浓度和 A260/280
8、的比值。b)根据上述测定浓度,取 200 ng DNA,加入 2 L 溴酚蓝,在 1%的琼脂糖凝胶上电泳,加入 5000 bp marker 作对照,稳压 100 V,电泳缓冲液为 1 TBE,电泳结束后用凝胶成像系统记录拍照。c)根据微量核酸蛋白检测仪的定量结果,将样品稀释成 20 ng/L,在-20下保存备用。3.5 目的片段目的片段 PCR 扩增扩增 3.5.1 16 对 SSR 引物及序列见附录 B。3.5.2 目的片段扩增反应体系为 15 L,具体试剂用量见表 1。表表 1 PCR 扩增扩增反应反应体系体系 试剂 浓度 所需体积(L)PCR buffer 10 PCR buffer(
9、Mg2+Plus)1.5 Taq 酶 5 U/L 0.2 Forward Primer 5 mM 1 Revere Primer 5 mM 1 DNA 20 ng/L 2 dNTP 5 mM 0.3 dUTP 250 nM 1 LY/T 31072019 3 H2O 6.8 3.5.3 PCR 扩增反应 将配制的扩增体系加入到 8 连管或 96 孔 PCR 板中,盖上管盖后涡旋混匀,在 3000 rpm 下离心 5 s,放入 PCR 仪中扩增,扩增程序为:1)94 变性 4 min;2)94 变性 30 s,55 退火 30 s,72 延伸 1 min,共 35 个循环;3)72 延伸 10
10、min,15 保存。3.6 目的片段检测目的片段检测 3.6.1 PCR 产物变性 PCR 产物用双蒸水稀释 10-15 倍,取 1L 稀释产物加入到 9 L 的 Loading buffer(91%超纯甲酰胺,9%内标 Genescan 500 Rox)后混匀;在 PCR 仪上运行变性程序:95变性 5 min,迅速放冰上冷却。3.6.2 PCR 扩增产物检测 PCR 产物检测采用 ABI PRISM 3130 xl 分析系统。从数据采集软件中创建一个片段分析程序,选择片段分析模式以及光谱校正所用试剂盒类型。创建一个自动分析模板,填写分析样品名称,选择样品类型、内标类型、分析方法等。将变性的
11、产物转入 96 孔 PCR 板,盖上仪器自带的 PCR 板盖,放入仪器中。在软件中将 PCR 板链接到仪器,点击开始进行基因型分型。3.6.3 PCR 扩增产物条带分析 采用基因型分析软件打开基因型分型的结果,根据内参大小直接读出每个样品目的片段的大小。4 送检样品分析送检样品分析 送检样品分析程序为:a)随机选取附录 B.1 中的一对 SSR 引物,对待检样品进行 PCR 扩增。b)将待检样品扩增得到的条带和附录 C.1-C.2 中对应引物的标准谱带相比较。c)如果所有扩增条带和附录 C.1-C.2 中对应引物某一品种的标准谱带完全相同,即判定为相同品种;如果扩增条带和其中几个品种的条带完全
12、相同,则增加一对引物进行检测,直至检测到唯一匹配的品种。d)如果待检样品所有扩增条带有一个以上位点与标准谱带不同,即判定为不同品种。e)根据基因型频率判定所鉴定品种真实性的准确率,见附录D。LY/T 31072019 4 附录附录 A(资料性附录)(资料性附录)本标准本标准适用鉴定适用鉴定的的柳树柳树品种品种表表 表表 A.1 本标准本标准适用鉴定的柳树适用鉴定的柳树品种品种 序号 品种中文名 拉丁名 1 苏柳 172 Salix jiangsuensis CL J172 2 苏柳 485 S.jiangsuensis CL 485 3 苏柳 52-2 S.jiangsuensis CL 52
13、-2 4 苏柳 795 S.jiangsuensis CL J795 5 苏柳 799 S.jiangsuensis CL J799 6 苏柳 J932 S.jiangsuensis CL J932 7 簸杞柳 JW9-6 S.integra S.suchowensis JW9-6 8 簸杞柳 JW8-26 S.suchowensis S.integra JW8-26 9“旱沙王”北沙柳 S.psammophila Hanshawang 10 银芽柳 J1037 S.agyrobractealis J1037 11 银芽柳 J1050 S.agyrobractealis J1050 12 银芽
14、柳 J1055 S.agyrobractealis J1055 13 银芽柳 J887 S.agyrobractealis J887 14 金丝垂柳 J1010 S.aureo-pendula J1010 15 金丝垂柳 J1011 S.aureo-pendula J1011 16 花叶柳 S.integra var.Hakuro Nishiki 17 渤海柳 1 号 S.matsudana Koidz Bohailiu-1 18 渤海柳 2 号 S.matsudana Koidz Bohailiu-2 19 渤海柳 3 号 S.matsudana Koidz Bohailiu-3 20 渤海
15、柳 4 号 S.matsudana Koidz Bohailiu-4 21 旱柳 S.matsudana Koidz 22 沙柳 S.psammophila 23 黄柳 S.gordejevii Chang et SkV.LY/T 31072019 5 附录附录 B(规范性附录)(规范性附录)柳树柳树品种鉴别品种鉴别 16 对对 SSR 引物引物序列序列 表表 B.1 柳树品种鉴别的柳树品种鉴别的 16 对对 SSR 引物引物 序号 引物名称 引物正向序列(5-3)引物反向序列(5-3)1 W254-1 AACATTCTGCTTCTTCCTTT AACCTCCATTACCATCCATA 2 W
16、46-460 AAGCAAGCAAAAGTCAAGAG AGTATGCCAAGCAAGAAGAA 3 W64-41 TCAGAGCCTGGTTCATAA ACAAATGCCAGAGCTAAA 4 W64-65 GCATACTTGGGCGTTGAT TGACTTGGGTTGGGTTTT 5 W64-255 GTCTGAACCCTCATCTAT CTGGAATCCATAATACAC 6 W64-272 TCACTTGCCGCCCTTCTT TGACGCCGCTGTAACCAC 7 W64-286 AAAGAATACATTTTAGGTGGAT TTCAAGGTTCAATCAAGTTA 8 W64-2
17、93 GCAAAAGCCAAAAGGAGA AACCAGCAGAGGAAAGTG 9 W64-311 AGAGCAAAGCACATTTCA ATACATCTACTGCCACCC 10 W253-12 ATCAAATCACGCTAATCC AACAAGAAAGCAACATCG 11 W253-17 ATTGAATGGGCACTAACC GCACTTCCACCTACCTCC 12 W253-38 CCCACCAAAGCGTCTGTC CGAGTTGTTGGGCTGGAT 13 W253-47 TTATTGCTGGAAAGGTTG TTCGTGTCTTTAGGGTCT 14 W-292-5 AAAG
18、AAGGCAAACAAAGCA AAACAGCGAAAGAAGCAAA 15 W253-22 GCCTCTGTTCCCATGACC TGAGGACTGGAGCGGATT 16 W-265-23 TGGGAGGAGTGTCAGAAG CTCCATAACAACCAGCAA LY/T 31072019 6 附录附录 C(资料性附录)(资料性附录)16 对对引物鉴定引物鉴定柳树柳树品种指纹图谱品种指纹图谱表表 表表 C.1 引物引物 W254-1、W46-460、W64-41、W64-65、W64-255、W64-272、W64-286 和和 W64-293 鉴定柳树品种指纹图谱鉴定柳树品种指纹图谱表
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