DB21∕T 2533-2015 赤羽病病毒荧光PCR检测方法.pdf
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1、ICS 65.020.30 B 41 DB21 辽宁省地方标准 DB21/T 25332015 赤羽病病毒荧光 PCR 检测方法 Method of the real-time RT-PCR for the detection of Akabane virus 2015-10-15 发布 2015-12-15 实施 辽宁省质量技术监督局 发 布 DB21/T 25332015 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由辽宁出入境检验检疫局提出并归口。本标准起草单位:辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人:万超、吴斌、屈菲。DB21/T 25332015 1 赤羽病
2、病毒实时荧光 PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了赤羽病病毒(Akabane virus)实时荧光PCR检测方法。本标准适用于赤羽病病毒的检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 SN/T 1193 基因检验实验室技术要求 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。Ct值:达到阈值的循环数(Cycle Threshold)DEPC:焦碳酸乙二酯(Diethylpyrocarbonate)Taq酶:TaqDN
3、A聚合酶(Taq DNA polymerase)RNA:核糖核酸(Ribonucleic Acid)实时荧光PCR:荧光逆转录聚合酶链反应(Real Time Fluorescent Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)4 原理 采用TaqMan方法,比对赤羽病病毒基因组S基因的核苷酸序列,设计特异性引物和特异性的荧光双标记探针进行配对。探针5端标记FAM荧光素为报告荧光基团(用R表示),3端标记TAMRA荧光素为淬灭荧光基团(用Q表示),它在近距离内能吸收5端荧光基因发出的荧光信号。PCR反应进入退火阶段时
4、,引物和探针同时与目的基因片段结合,此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基因所吸收,仪器检测不到荧光信号;而反应进行到延伸阶段时,Taq酶的5到3的外切核酸酶功能将探针降解。这样探针上的R基团游离出来,所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环进行,PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。5 试剂和材料 除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的一级水;所有试剂均用无RNA酶的容器分装。5.1 试剂 DB21/T 25332015 2 5.1.1 DEPC 水(见附录 A.1)。5.1.2 0.01mol/L PBS(见附录 A.2)5.1.3 T
5、rizol 裂解液。5.1.4 三氯甲烷。5.1.5 75%乙醇(见附录 A.3)。5.1.6 异丙醇(-20预冷)。5.1.7 其他试剂:荧光 PCR 反应缓冲液:含 50mmol/L KCl(见附录 A.4),10mmol/L Tris-HCl(pH8.3)(见附录 A.5),2.5 mmol/L MgCl2(见附录 A.6)。可采用等效商品化试剂。5.1.8 dNTP Mixture(各 10 mM)、EX-Taq酶(5 U/L)。5.1.9 引物:合成一对特异性引物:上游引物 5-CCCCTGGTGCTGAGATGTTT-3,下游引物 5-CTTCCTCATGAAGTTGACATCCA
6、T-3,TaqMan 探针(FAM)5-ACCCACTGGTTATCGACATGCACCG-3(TAMRA)均配制成 5 umol/L,-20 保存。5.2 仪器与耗材 5.2.1 荧光 PCR 检测仪。5.2.2 高速台式冷冻离心机(最高可达 13 000 r/min)。5.2.3 微量移液器:0.5 L10 L,5 L20 L,20 L200 L,100 L1000 L。5.2.4 混匀器。5.2.5 冰箱(2-8)。5.2.6 研钵。5.2.7 微量可调移液器。5.2.8 离心管。5.2.9 吸水纸。5.2.10 离心管 5.2.11 微量带芯吸嘴(10L,100L,1000L)。6 生
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