DB21∕T 2533-2015 赤羽病病毒荧光PCR检测方法.pdf

ICS 65.020.30 B 41 DB21 辽宁省地方标准 DB21/T 25332015 赤羽病病毒荧光 PCR 检测方法 Method of the real-time RT-PCR for the detection of Akabane virus 2015-10-15 发布 2015-12-15 实施 辽宁省质量技术监督局 发 布 DB21/T 25332015 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由辽宁出入境检验检疫局提出并归口。本标准起草单位：辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人：万超、吴斌、屈菲。DB21/T 25332015 1 赤羽病病毒实时荧光 PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了赤羽病病毒（Akabane virus）实时荧光PCR检测方法。本标准适用于赤羽病病毒的检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 SN/T 1193 基因检验实验室技术要求 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。Ct值：达到阈值的循环数（Cycle Threshold）DEPC：焦碳酸乙二酯（Diethylpyrocarbonate）Taq酶：TaqDNA聚合酶（Taq DNA polymerase）RNA：核糖核酸（Ribonucleic Acid）实时荧光PCR：荧光逆转录聚合酶链反应（Real Time Fluorescent Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）4 原理 采用TaqMan方法，比对赤羽病病毒基因组S基因的核苷酸序列，设计特异性引物和特异性的荧光双标记探针进行配对。探针5端标记FAM荧光素为报告荧光基团（用R表示），3端标记TAMRA荧光素为淬灭荧光基团（用Q表示），它在近距离内能吸收5端荧光基因发出的荧光信号。PCR反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基因所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶的5到3的外切核酸酶功能将探针降解。这样探针上的R基团游离出来，所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。5 试剂和材料 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水；所有试剂均用无RNA酶的容器分装。5.1 试剂 DB21/T 25332015 2 5.1.1 DEPC 水（见附录 A.1）。5.1.2 0.01mol/L PBS（见附录 A.2）5.1.3 Trizol 裂解液。5.1.4 三氯甲烷。5.1.5 75%乙醇（见附录 A.3）。5.1.6 异丙醇（-20预冷）。5.1.7 其他试剂：荧光 PCR 反应缓冲液：含 50mmol/L KCl（见附录 A.4）,10mmol/L Tris-HCl（pH8.3）（见附录 A.5）,2.5 mmol/L MgCl2（见附录 A.6）。可采用等效商品化试剂。5.1.8 dNTP Mixture(各 10 mM)、EX-Taq酶(5 U/L)。5.1.9 引物：合成一对特异性引物：上游引物 5-CCCCTGGTGCTGAGATGTTT-3，下游引物 5-CTTCCTCATGAAGTTGACATCCAT-3，TaqMan 探针（FAM）5-ACCCACTGGTTATCGACATGCACCG-3（TAMRA）均配制成 5 umol/L，-20 保存。5.2 仪器与耗材 5.2.1 荧光 PCR 检测仪。5.2.2 高速台式冷冻离心机（最高可达 13 000 r/min）。5.2.3 微量移液器：0.5 L10 L，5 L20 L，20 L200 L，100 L1000 L。5.2.4 混匀器。5.2.5 冰箱(2-8)。5.2.6 研钵。5.2.7 微量可调移液器。5.2.8 离心管。5.2.9 吸水纸。5.2.10 离心管 5.2.11 微量带芯吸嘴（10L，100L，1000L）。6 生物安全要求 采样、样品处理及检测过程所涉及的实验操作，应遵守 SN/T 1193 的有关规定。7 操作步骤 7.1 样本的采集与处理 7.1.1 血样前处理：取 2ml 全血样品,3000g 离心 10min，弃沉淀，收集上清。继续进行核酸提取。7.1.2 组织样品前处理：取 100mg 组织样品，剪碎，按 1：5 的比例加 0.01mol/L pH7.6PBS 研磨后冻融 3 次，离心，取上清液，-20保存，备用或直接继续进行核酸提取。7.2 核酸提取 所有RNA提取器皿用DEPC水浸泡24h，灭菌后方可使用。自上述完成前处理的样品中加入1ml Trizol裂解液，室温放置5min。加入0.2ml三氯甲烷，剧烈振荡15秒，室温放置3min，410000g离心15min。将水相转移到新管中，加入500l异丙醇(-20预冷)，室温放置10min，410000g离心10min，吸取离心后的上清液转移至相应的新管中，上清液约吸取500l（注意不要吸出中间白色絮状层），轻轻颠倒DB21/T 25332015 3 均匀。于4条件下，12000r/min离心15min。取出Eppendorf管，轻轻倒去上清液，加入1ml 75%乙醇，颠倒洗涤。于4条件下，12000r/min离心15min。取出Eppendorf管，轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。每管加入20l灭菌DEPC水，轻轻混均，溶解管壁上的RNA，2000r/min离心5s，冰上保存备用。提取的RNA应在2h内进行RT-PCR 扩增或放置于-70冰箱备用。7.3 实时荧光 PCR 反应 7.3.1 反转录 于7.2 eppendorf管中依次加入：10反转录酶缓冲液（200 mM Tris/HCl,pH 8.4,和 500 mM KCl），2l；下游引物4l；dNTPs(10 mM each dATP,dCTP,dGTP,dTTP)，2l；MgCl2(25 mM)2.0l；DTT（0.1M）2.0 l；AMV反转录酶(200 units/l)，0.5l，补水至20l。瞬时离心，95 5min,45 40min。立即进行PCR扩增或-20保存备用。7.3.2 荧光 PCR 反应体系:10PCR 缓冲液，2.5L；2.5mmol/L MgCL2 5L；10 mmol/L DNTP 0.75L,10mol/L 上下游引物 1L，5mol/L 探针 1L，0.5L Taq 酶(2U/L),DNA 2L 用 DEPC 水补足 25L体系。需配制的荧光 PCR 预混反应液数量=样品个数+对照个数+1。将各试剂按使用量吸取到微量离心管中，充分混匀，然后再每个 PCR 光学管中分装 25L。7.3.3 反应参数 将7.3.1中离心后的PCR管放入实时荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。循环参数设置如下：第一阶段，变性 95 5 min,反转录 45 40 min；第二阶段，预变性 95 5 min；第三阶段，95 30 s、60 1 min，40 个循环，荧光收集设置在第三阶段每次循环的退火延伸时进行。8 结果判定 8.1 结果分析条件设定 读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。8.2 质控标准 8.2.1 阴性对照无 Ct 值并且无扩增曲线。8.2.2 阳性对照的 Ct 值应28，并出现特定的扩增曲线。8.2.3 如阴性对照和阳性对照条件不满足以上条件，此实验视为无效。8.3 结果描述及判定 8.3.1 阴性判定 无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无赤羽病病毒核酸。8.3.2 阳性判定 Ct值30，且出现特定的扩增曲线，表示样品中存在赤羽病病毒核酸。DB21/T 25332015 4 A A 附 录 A(规范性附录)试剂的配制 A.1 DEPC水 去离子水按0.1%加入DEPC，37静置过夜，采用(121士2)/0.1Mpa,15min高压灭菌后贮存于4。A.2 0.01mol/L PBS 先配制A液、B液。A液(0.2mol/L NaH2PO4溶液)：称取一水合磷酸二氢钠(NaH2PO4H20)27.6g,或二水合磷酸二氢钠(NaH2PO42H20)31.2g，溶于蒸馏水中，定容至1L。B液(0.2mol/L Na2HPO4溶液)：称取十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO412 H20)71.6g，或二水合磷酸氢二钠(Na2HPO42H20)35.6g，溶于蒸馏水中，定容至1L。称取17g氯化钠，用适量蒸馏水溶解，量取13mL A液和87mL B液，混合，用蒸馏水定容至2L。采用(121士2)/0.1Mpa,15min高压灭菌后贮存于4。A.3 75乙醇溶液 量取75ml无水乙醇溶液，加入双蒸水中，充分混匀，定容至100ml。室温保存。A.4 50mmol/L 氯化钾（50mmol/L KCl）称取3.73g氯化钾，加入双蒸水，充分溶解，定容至1000ml。室温贮存。A.5 10mmol/L Tris-HCl 称取 0.3028g Tris，用双蒸水溶解，然后用 HCl 调节 pH 至 8.0，最后定容到 250mL，室温贮存。A.6 2.5 mmol/L MgCl2 称取0.059g MgCl2，用双蒸水溶解，定容到250mL，采用(121士2)/0.1Mpa,15min高压灭菌后贮存于4。_