DBS32∕ 004-2014 食品安全地方标准 青奥会食品中致病菌快速检测.pdf
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1、 DBS 江苏省地方标准 DBS 32/0042014 食品安全地方标准 青奥会食品中致病菌快速检测 2014-06-30 发布 2014-06-30 实施 江苏省卫生和计划生育委员会 发 布 DBS 32/0042014 I 前 言 本标准系首次发布。DBS 32/0042014 1 青奥会食品中致病菌快速检测 1 范围 本标准规定了食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌 O157:H7、副溶血性弧菌的病原菌自动检测系统检测方法和实时荧光 PCR 检测方法,以及志贺氏菌实时荧光PCR 检测方法。本标准适用于 2014 年青奥会食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺
2、氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌 O157:H7、副溶血性弧菌的快速检测。其他大型活动可参考本标准执行。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。第一法 病原菌自动检测系统检测 3 原理 病原菌自动检测系统利用多聚酶链反应(PCR)扩增目标细菌DNA特异片段,筛选目标菌是否存在。反应所需的引物、DNA聚合酶和单核苷酸等被合并成为一个稳定、干燥的试剂片,装入PCR反应管中,检测系统运用荧光检测来分析PCR产物。PCR试剂片含有荧光染料,能结合双链DNA
3、,受光激发后能发出荧光信号。在检测过程中,病原菌自动检测系统通过测量荧光信号的变化,分析测量数据,判定阳性或阴性结果。4 设备和材料 4.1 病原菌自动检测系统。4.2 恒温空气振荡摇床:36 1、30 1。4.3 加热槽:37 1、95 1。4.4 冷却槽。4.5 天平:感量 0.1 g。4.6 均质器。4.7 冰箱:4、-20。4.8 微量移液器:1 L-10 L、10 L-100 L、100 L-1000 L。DBS 32/0042014 2 4.9 灭菌吸头:10 L、200 L、1000 L。4.10 PCR 反应管及支架。4.11 pH 计或 pH 试纸。5 试剂与培养基 5.1
4、水:应符合 GB/T 6682 中一级水的规格,121高压灭菌 30 min。5.2 病原菌自动检测系统检测试剂盒(溶菌试剂、试剂片)。5.3 培养基 5.3.1 7.5%氯化钠肉汤:见 GB 4789.10-2010 附录 A 中 A.2。5.3.2 缓冲蛋白胨水(BPW):见 GB 4789.4-2010 附录 A 中 A.1。5.3.3 亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液:见 GB 4789.4-2010 附录 A 中 A.3。5.3.4 李氏增菌肉汤 LB(LB1,LB2):见 GB 4789.30-2010 附录 A 中 A.3。5.3.5 改良 EC 肉汤:见 GB/T 4789.36-
5、2008 附录 A 中 A.1。5.3.6 3氯化钠碱性蛋白胨水:见 GB 4789.7-2013 附录 A 中 A.1。6 操作步骤 6.1 样品制备和增菌培养 6.1.1 金黄色葡萄球菌 金黄色葡萄球菌的样品处理与增菌液按照GB 4789.10-2010中第一法5.1进行,增菌液放置于恒温空气振荡摇床中,36 1、200 rpm/min振摇4 h。6.1.2 沙门氏菌 沙门氏菌的样品处理与增菌液按照 GB 4789.4-2010 中 5.1 前增菌和 5.2 进行,BPW 增菌液放置于恒温空气振荡摇床中,36 1、200 rpm/min 振摇 2 h;移取 0.1 mL,转接种于 SC 增
6、菌液,36 1,200 rpm/min 振摇 4 h。6.1.3 单核细胞增生李斯特氏菌 单核细胞增生李斯特氏菌的样品处理与增菌液按照GB 4789.30-2010中5.1进行,LB1增菌液放置于恒温空气振荡摇床中,30 1、200 rpm/min振摇2 h;移取0.1 mL,转种于10 mL LB2 增菌液内,30 1,200 rpm/min振摇4 h。6.1.4 大肠埃希氏菌 O157:H7 大肠埃希氏菌O157:H7的样品处理与增菌液按照GB/T 4789.36-2008中第一法5.1进行,增菌液放置于恒温空气振荡摇床中,36 1、200 rpm/min振摇4 h。DBS 32/0042
7、014 3 6.1.5 副溶血性弧菌 副溶血性弧菌的样品处理与增菌液按照GB 4789.7-2013中5.1进行,增菌液放置于恒温空气振荡摇床中,36 1、200 rpm/min振摇4 h。6.1.6 所有剩余增菌液均存于 28,以备对阳性检测结果的确认。6.2 上机操作 6.2.1 打开加热槽分别至 37和 95。检查预冷的冷却槽(4)。开机并启动病原菌自动检测系统软件。如果仪器自检后显示“校正”,按屏幕提示进行校正操作。6.2.2 溶菌操作 将标记好的溶菌管放至管架上,在每支溶菌管加入200 L溶菌试剂。将每个增菌后的5 L样品加入相应的溶菌管中,盖上盖子。把管架放在37加热槽中20 mi
8、n。再将管架放在95的加热槽中10 min。最后将管架放在冷却槽上(冷却槽从冰箱取出后30 min内使用完毕),样品冷却5 min。6.2.3 溶菌产物转移 将PCR反应管支架放到专用冷却槽上,然后将含有试剂片的PCR反应管放入到支架内。用加样器将50 L溶菌产物加入管中,密封PCR反应管。换用新吸头,重复上述操作,直至将所有样品转入PCR反应管中。6.2.4 扩增和检测 在系统中输入标本号并在“Target”项目下选择相应的致病菌,然后点击“Apply”确定,再点击升温图标,开始预热仪器。待预热结束后,将加入溶菌产物的PCR反应管放入仪器中。运行软件至反应结束。6.3 实验结果与报告 实验结
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