《蛋白组学》.ppt

第三章第三章 蛋白质组与蛋白质组学蛋白质组与蛋白质组学1整理ppt 第第一节一节 蛋白质组与蛋白质组学的定义蛋白质组与蛋白质组学的定义 蛋白质组 protein+genome proteome 一种基因组所表达的全部蛋白质 一个细胞或一个机体的基因所表达的全部蛋白质2整理ppt蛋白质组学l阐明生物体全部蛋白质的表达模式与功能模式l从整体的角度分析、鉴定细胞内动态变化的蛋白质的组成、结构、性质、表达水平与修饰状态l了解蛋白质之间、蛋白质与大分子之间的相互作用与联系,揭示蛋白质的功能与细胞生命活动的规律 一、蛋白质组与蛋白质组学的定义一、蛋白质组与蛋白质组学的定义3整理ppt蛋白质组学研究意义和背景 l目前功能基因组中所采用的策略，如基因芯片、基目前功能基因组中所采用的策略，如基因芯片、基因表达序列分析等，都是从细胞中因表达序列分析等，都是从细胞中mRNA的角度来的角度来考虑的，其前提是细胞中考虑的，其前提是细胞中mRNA的水平反映了蛋白的水平反映了蛋白质表达的水平。但事实并不完全如此，质表达的水平。但事实并不完全如此，4整理pptlDNA mRNA 蛋白质蛋白质转录水平调控转录水平调控翻译水平调控翻译水平调控翻译后修饰翻译后修饰蛋白质的亚细胞定位蛋白质的亚细胞定位蛋白质之间的互相作用蛋白质之间的互相作用蛋白质组学的研究意义和背景5整理pptDNAmRNA蛋白质转录翻译基因蛋白质细胞特异性基因表达生理状态蛋白质相互作用温度应激状态培养条件药物作用数量有限结构相对稳定复杂性多变性直接反应生命现象复杂的调控6整理pptl蛋白质组学一经出现，就有两种研究策略。蛋白质组学一经出现，就有两种研究策略。l一种可称为一种可称为“竭泽法竭泽法”，即采用高通量的蛋白质，即采用高通量的蛋白质组研究技术分析生物体内尽可能多乃至接近所组研究技术分析生物体内尽可能多乃至接近所有的蛋白质。有的蛋白质。（全蛋白组的研究）（全蛋白组的研究）l另一种策略可称为另一种策略可称为“功能法功能法”，即研究不同时期，即研究不同时期细胞蛋白质组成的变化，如蛋白质在不同环境细胞蛋白质组成的变化，如蛋白质在不同环境下的差异表达，以发现有差异的蛋白质种类为下的差异表达，以发现有差异的蛋白质种类为主要目标。这种观点更倾向于把蛋白质组学作主要目标。这种观点更倾向于把蛋白质组学作为研究生命现象的手段和方法。为研究生命现象的手段和方法。（差异表达的（差异表达的蛋白质组）蛋白质组）蛋白质组学研究的策略蛋白质组学研究的策略7整理ppt蛋白质组学研究的范围蛋白质组学研究的范围l蛋白质的表达模式蛋白质的表达模式 l蛋白质翻译后修饰研究蛋白质翻译后修饰研究 l蛋白质蛋白质-蛋白质相互作用的研究蛋白质相互作用的研究8整理ppt二、蛋白质组学的研究方法二、蛋白质组学的研究方法 差异蛋白组学差异蛋白组学9整理ppt生物学问题生物学问题的提出的提出实验模型实验模型的设计的设计实验组和对照组实验组和对照组样品的制备样品的制备蛋白样品的蛋白样品的IEF和和PAGE电泳分离电泳分离图像扫描和初步分析图像扫描和初步分析感兴趣感兴趣蛋白点蛋白点的切取的切取胰酶胰酶对脱色后蛋白质的消化对脱色后蛋白质的消化质谱质谱的多肽指纹图、微测序分析的多肽指纹图、微测序分析质谱结果的质谱结果的生物信息学生物信息学分析和比对分析和比对新蛋白质的发现新蛋白质的发现其它实验其它实验的进一步的进一步验证验证蛋白信息的蛋白信息的初步获得初步获得10整理ppt第一步、蛋白质分离蛋白质组分析的首要要求l将来自于全细胞、组织或生物体中所包含将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测和分析和分析。Pellet and extract supernatant Sonicate in lysis buffer11整理ppt样品制备样品制备要求：重复性好要求：重复性好 蛋白质损失少蛋白质损失少 无核酸无核酸 去除高丰度或无关蛋白去除高丰度或无关蛋白 浓度浓度12整理ppt 以肿瘤蛋白质组学研究为例说明以肿瘤蛋白质组学研究为例说明肿瘤蛋白质的来源肿瘤蛋白质的来源（1）以肿瘤细胞为研究材料l不同的肿瘤细胞；l正常细胞与癌变细胞优点优点:易获得易获得缺点缺点:这些细胞系从组织中分离出来并经体这些细胞系从组织中分离出来并经体 外培养后蛋白质会发生许多变化外培养后蛋白质会发生许多变化13整理ppt（2）外科手术切除的肿瘤组织外科手术切除的肿瘤组织优点优点:来源较为方便来源较为方便缺点缺点:整个组织包括基质，纤维原细胞，免疫整个组织包括基质，纤维原细胞，免疫细胞等，组织匀浆困难，不易分离总蛋白而蛋细胞等，组织匀浆困难，不易分离总蛋白而蛋白质组研究需要的通常是白质组研究需要的通常是单一单一的细胞类型。的细胞类型。14整理ppt（3）以激光捕获显微切割（）以激光捕获显微切割（LCM）肿瘤）肿瘤细胞细胞LCM是直接从冰冻或石蜡包埋肿瘤组织切片中获是直接从冰冻或石蜡包埋肿瘤组织切片中获取细胞。它是用乙烯醋酸盐聚合体膜覆盖在被选取细胞。它是用乙烯醋酸盐聚合体膜覆盖在被选择的细胞上，然后用红外激光熔化膜，这时膜与择的细胞上，然后用红外激光熔化膜，这时膜与组织在目标位置牢固结合，当膜被提起时，仅目组织在目标位置牢固结合，当膜被提起时，仅目的细胞留在膜上。的细胞留在膜上。优点：能准确切取肿瘤细胞优点：能准确切取肿瘤细胞缺点：需昂贵的仪器缺点：需昂贵的仪器15整理ppt第二步、蛋白质的分离第二步、蛋白质的分离二维色谱二维色谱毛细管电泳毛细管电泳 双向电泳双向电泳(2DE)Ettan DALTsixEttan IPGphor IEF unit16整理pptl2-DE技术依然是大多数蛋白质组研究中分离复杂蛋白质混合物的首选技术。大鼠肝线粒体蛋白质组图谱大鼠肝线粒体蛋白质组图谱17整理ppt1、双向凝胶电泳、双向凝胶电泳(2DE)第一向第一向:等电聚焦（等电聚焦（IEF）第二向第二向:SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）Ettan IPGphor IEF unitEttan DALTsix18整理ppt等电聚焦等电聚焦是利用蛋白质分子的等电点不同，是利用蛋白质分子的等电点不同，在一个稳定的、连续的、线形在一个稳定的、连续的、线形pHpH梯度中进行梯度中进行蛋白质的分离和分析。蛋白质的分离和分析。pH3pH10+-+-+-+-+Time0+-+-+-+-+Time1-+Time219整理pptSDS-PAGESDS-PAGE电泳电泳是根据是根据SDSSDS和还原试剂将蛋和还原试剂将蛋白质分子解聚后亚基的大小，在恒定的白质分子解聚后亚基的大小，在恒定的pHpH缓冲系统中的分离。缓冲系统中的分离。20整理ppt21整理ppt2、2D DIGE22整理ppt2D-DIGEl差异凝胶电泳技术(difference gel electrophoresis,DIGE),其可以将三个样品用Cy2、Cy3、Cy5染料染色后，等量混合，在同一块胶上进行双向电泳分离，这样可以降低胶条和操作带来的误差。15 min,4 C in the darkQuench with lysine30 min,4 Cin the darkAdd dye to protein400 pmol dyeper 50 mg proteinReconstitute the dyes23整理pptSeparate by 2D-PAGEPooled internal standardLabel with Cy2Protein extract 2Label with Cy5Protein extract 1Label with Cy3Mix labelled samplesVolumes expressed as ratios relative to pooled internal standardD DI IG GE E 流流程程图图凝凝胶胶内内差差异异显显示示电电泳泳24整理pptCy2-labeled internal standardCy3-labeled controlCy5-labeled disease第三步、凝胶内蛋白质差异分析 25整理pptDeCyder softwarelDesigned to detect and match fluorescent 2D images lLoad up to 18 image pairs.lDeCyder software automatically:Co-detects image pairsRemoves backgroundRemoves dust particlesNormalises imagesMatches up to 18 image pairst-test and ANOVA calculated for each spot setData displayed as Trend analysis graph26整理ppt27整理pptcontroldiseaseVolume ratio=2.8728整理ppt第四步、质谱鉴定第四步、质谱鉴定l质谱技术是蛋白质组学研究中最为广泛使用的蛋白质鉴定技术。其基本原理是样品分子 离子化后，根据不同离子间质荷比（M/Z）的差异来分离并确定分子质量。AtmosphereVacuum SystemSample InletDetectorData SystemMass AnalyserIonisation Method29整理ppt质谱分析lMALDI-TOF-MSlLC-MS-MS30整理ppt 通过数据库的比对获取感兴趣的蛋白质通过数据库的比对获取感兴趣的蛋白质的相关研究，来进一步地进行研究！的相关研究，来进一步地进行研究！31整理ppt 蛋白质亲和层析 亲和印迹 免疫沉淀 交联 酵母双杂交 噬菌体展示 生物传感芯片质谱 蛋白质工程中的定点诱变技术 一、蛋白质蛋白质研究方法研究方法传统技术传统技术新技术新技术第五步第五步 蛋白质相互作用的研究方法蛋白质相互作用的研究方法32整理ppt一、蛋白质蛋白质蛋白质相互作用的研究方法蛋白质相互作用的研究方法 1.酵母双杂交系统 2.噬菌体展示 3.生物传感芯片质谱 4.定点诱变技术33整理ppt 1.1.酵母双杂交系统酵母双杂交系统 DNA-BD具有与报告基因转录调控区特异结合的功能，DNA-AD则具有活化转录的功能。报告基因一、蛋白质蛋白质34整理pptlDNA-BD和DNA-AD分开时不能激活转录，只有当两者在空间上接近时，才能呈现转录因子的活性。l只有当蛋白质X与蛋白质Y间发生相互作用时，才能激活报告基因的转录，而当两者单独作用时均无此功能。一、蛋白质蛋白质35整理ppt2、噬菌体展示技术1、以改造的噬菌体为载体。2、cDNA基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白基因区。36整理ppt2、噬菌体展示技术3、使外源蛋白表达并展示于噬菌体表面。4、通过亲和富集法筛选表达有特异蛋白质的噬菌体。37整理pptn n抗原表位的筛选 n n蛋白相互作用筛选 n n酶的底物和拮抗剂的筛选 n n受体的激活剂和拮抗剂的筛选 2、噬菌体展示技术38整理ppt蛋白质组研究的技术路线流程图蛋白质组研究的技术路线流程图样品样品细胞、组织、体液细胞、组织、体液双向电泳双向电泳电转印到膜上电转印到膜上图像分析、数据处理图像分析、数据处理胶上原位酶切胶上原位酶切肽混合物肽混合物MALDI/TOF/MS肽质量指纹谱肽质量指纹谱数据库检索数据库检索数据库检索数据库检索蛋白质鉴定蛋白质鉴定Edman降解降解氨基酸分析氨基酸分析ESI/MS/MSPSD/MALDI/TOF/MS肽序列标签肽序列标签氨基酸组成氨基酸组成N端序列端序列39整理ppt四、蛋白质组研究四、蛋白质组研究在医学中的应用在医学中的应用40整理ppt（一）用于疾病诊断的研究（一）用于疾病诊断的研究l结核病：结核杆菌的诊断结核病：结核杆菌的诊断l恶性肿瘤的诊断：确定新的肿瘤标志物恶性肿瘤的诊断：确定新的肿瘤标志物肿瘤类型肿瘤类型肿瘤相关性蛋白质肿瘤相关性蛋白质肺癌肺癌乳腺癌乳腺癌膀胱癌膀胱癌直结肠癌直结肠癌肾细胞癌肾细胞癌卵巢癌卵巢癌前列腺癌前列腺癌神经母细胞癌神经母细胞癌TAO1,TAO2P50.9Psoriasin,Galectin,StratifinCalgranulin BUbiquinol,Cytochrome C reductaseOP18,PHSP60,HSP90,Calreticulin,Tropomysin-1,2Oncoprotein 18,Elongation factor 2,Glutathion S,et al.P19/nm23-HI41整理ppt（二）用于发病机制的研究（二）用于发病机制的研究l阐明肿瘤发病机制阐明肿瘤发病机制l神经科学，包括学习、记忆的机制，以神经科学，包括学习、记忆的机制，以及神经病变机制研究及神经病变机制研究42整理ppt（三）用于药物开发（三）用于药物开发l开发抗肿瘤新药开发抗肿瘤新药l抗感染疫苗研究抗感染疫苗研究l药物毒理研究药物毒理研究l致病菌耐药性研究致病菌耐药性研究43整理ppt五、蛋白质组学研究中的困难五、蛋白质组学研究中的困难1.2-D电泳胶上的点只是细胞蛋白质中的一小部分，大部分不能被显示。2.难溶于水或分子量大于18万的蛋白质难于在 2-D胶上显示。3.质谱技术虽有较高的灵敏度，但对来自2-D胶上的许多低丰度的蛋白质仍不能鉴定。44整理ppt4.蛋白质的修饰对于蛋白质组蛋白质种类的确定将是一种“无限”的工作。5.蛋白质组研究任务是我们面临的“无尽挑战”。45整理ppt 第三节第三节蛋白质的生物合成及其干扰蛋白质的生物合成及其干扰46整理ppt蛋白质的生物合成参与物质蛋白质的生物合成参与物质l1.mRNA与密码子与密码子 47整理ppt48整理ppt49整理ppt2.氨基酸的运载工具：tRNA50整理ppt 3.核糖体肽链合成的“装配机器”51整理ppt52整理ppt多核糖体53整理ppt二、蛋白质的生物合成过程（一）、氨基酸的活化氨基酸活化的总反应式是：l 氨基酰-tRNA 合成酶l氨基酸+ATP+tRNA+氨基酰-tRNA+AMP+PPi54整理ppt氨基酸的活化氨基酸的活化 苯丙氨酸苯丙氨酸55整理ppt原核生物（细菌）为例：所需成分：30S小亚基、50S大亚基、模板mRNA、fMet-tRNAfMet、GTP、Mg2+翻译起始因子：IF-1、IF-2、IF-3、（二（二)、合成的起始、合成的起始56整理pptIF-3IF-1翻译起始(翻译起始复合物形成)又可被分成3步：1.核蛋白体大小亚基分离IF3-促使促使 30S亚基结合于亚基结合于 mRNA 起始部位，阻止起始部位，阻止30S亚基与亚基与50S亚基的结合，或者说促进亚基的结合，或者说促进70S核糖体的解离核糖体的解离57整理ppt2 2、30S30S小亚基通过与小亚基通过与mRNAmRNA的的SDSD序列模板相结合。序列模板相结合。A U G53IF-3IF-158整理pptS-D序列:在蛋白质合成起始时，mRNA上有一个很短的保守序列位于编码区前面，称为核糖体结合位点，称为S-D序列 59整理pptIF-3IF-1IF-2GTP3.3.在IF-2和GTP的帮助下，fMet-tRNA进入小亚基的P位，tRNA上的反密码子与mRNA上的起始密码子配对。A U G5360整理ppt4.70s起始复合物的形成l50s亚基与上述的亚基与上述的30s前起始复合物结合，前起始复合物结合，同时同时IF-2脱落，形成脱落，形成70s起始复合物。起始复合物。IF-3IF-1IF-2GTPA U G5361整理ppt a、核糖体较大核糖体较大 b、mRNA 是单顺反子是单顺反子 c、其其mRNA 具有具有m7GpppNp帽子结构，帽子结构，从而导致起始时识别信号的差异从而导致起始时识别信号的差异 d、Met-tRNAMet不甲酰化不甲酰化 e、有较多的起始因子有较多的起始因子 真核蛋白质合成起始的特点真核蛋白质合成起始的特点62整理ppt 起始机制起始机制 对对AUG的识别涉及：的识别涉及：Euk 蛋白质合成起始中的重要参与者：蛋白质合成起始中的重要参与者：密码子与反密码子的配对密码子与反密码子的配对 起始起始AUG上下文结构特点的作用上下文结构特点的作用 MettRNAi 核糖体核糖体 AUG上下文上下文特点特点 eIF 2作用作用 eIF-4F63整理pptmetmet40S40S60S60SMeMet tMetMet40S40S60S60SmRNAeIF-2BeIF-2B、eIF-3eIF-3、eIF-6 elF-3elF-3GDP+Pi各种各种各种各种elFelF释放释放释放释放elF-5ATPADP+PielF4E,elF4G,elF4A,elF4B,PABMetMet-tRNAMet-elF-2-GTP真核生物翻译起始真核生物翻译起始复合物形成过程复合物形成过程64整理ppt65整理ppt真核生物翻译起始复合物形成(区别原核生物)原核生物中原核生物中30S30S小亚基首先与小亚基首先与mRNAmRNA模板相模板相结合，再与结合，再与fMet-tRNAfMet-tRNAfMetfMet结合，最后与结合，最后与50S50S大亚基结合。而在真核生物中，大亚基结合。而在真核生物中，40S40S小亚小亚基首先与基首先与Met-tRNAMet-tRNAMetMet相结合，再与模板相结合，再与模板mRNAmRNA结合，最后与结合，最后与60S60S大亚基结合生成大亚基结合生成80SmRNAMet-tRNA80SmRNAMet-tRNAMetMet起始复合物。起始复合物。66整理ppt 三、三、肽链的延伸肽链的延伸 EFTu-GTP+氨酰基氨酰基-tRNA三元复合物三元复合物原核生物肽链的延伸原核生物肽链的延伸以氨酰以氨酰tRNA 进入进入70S 起始复合物的起始复合物的A位为标志（第一个进位位为标志（第一个进位过程）过程）1、进位进位 （1）三元复合物生成三元复合物生成 EFTu+GTP 67整理ppt （2）三元复合物进入三元复合物进入A位位 要求要求P位点被起始位点被起始 氨酰氨酰tRNA 或肽酰或肽酰tRNA占据占据 同时，同时，EF-Tu催化催化GTP水解，释放水解，释放 EF-Tu-GDP（3）Ts循环循环（TuTs 循环）循环）EFTs 能够使能够使 EFTuGDP转变为转变为 EFTuGTP 因为因为-EFTuGDP 不能有效地结合氨酰基不能有效地结合氨酰基tRNA 循环过程：循环过程：EF-Tu-GDPEF-TsEF-Tu-EF-TsGTP 取代取代EF-Tu-GTP68整理ppt69整理ppt 2、肽键生成（转肽反应）肽键生成（转肽反应）（1）肽酰转移酶肽酰转移酶（peptidyl transferase）位于核糖体大亚基，催化肽键生成位于核糖体大亚基，催化肽键生成 若干蛋白质、若干蛋白质、23S rRNA、5S rRNA（2）形成过程：形成过程：把两个氨酰把两个氨酰tRNA 定位于调准的位置定位于调准的位置将处于将处于P位的甲酰甲硫氨酰基或肽酰基转移位的甲酰甲硫氨酰基或肽酰基转移到到A位的氨酰基位的氨酰基tRNA 的氨基上形成肽键的氨基上形成肽键肽链延伸一个肽链延伸一个AA70整理ppt71整理ppt（1）需要需要GTP 和和 延伸因子延伸因子 EFG a、过程：过程：EFG 和和 GTP 结合结合-核糖体中具有核糖体中具有GTP酶活性的蛋白酶活性的蛋白GTP水解水解-A位生成的肽基转移到位生成的肽基转移到P位，位，P 位空位空载的载的 tRNA进入进入E位位（此过程（此过程 mRNA 移动了移动了一个密码子）一个密码子）3、移位（移位（translocation）肽键生成后，核糖体沿肽键生成后，核糖体沿mRNA 向前移动一个向前移动一个密码子的距离密码子的距离 72整理ppt b、EFG和和 GDP 必须释放必须释放c、核糖体固有的移位性质可被核糖体固有的移位性质可被 EFG 所催化所催化 73整理pptfMetA U G53fMetTuGTP74整理ppt 4、真核肽链的延伸真核肽链的延伸 与与 原核原核 相似相似 eEF1 取代取代 EFTu 和和 EFTs eEF2 取代取代 EFG 真菌真菌-eEF3 参与参与(维持翻译的准确性维持翻译的准确性)75整理ppt四、四、多肽链合成的终止多肽链合成的终止76整理ppt1、所需条件所需条件 （1）终止信号：终止密码子终止信号：终止密码子 原核原核 和和 真核都是：真核都是：UAA、UAG、UGA （2）释放因子：释放因子：a、RF 原核中，原核中，RF1-识别识别 UAA 和和 UAG RF2-识别识别 UAA 和和 UGA RF3-刺激刺激RF1 和和 RF2 的活性的活性真核中真核中 只有只有 eRF-识别三种终止密码子识别三种终止密码子 77整理ppt2、终止机制终止机制 （1）原核生物）原核生物a、RF 作用于作用于A 位点位点体外实验证实，体外实验证实，RF 与终止密码子与终止密码子之间特异的相互作用，类似于反密码子和密码子之间的碱基之间特异的相互作用，类似于反密码子和密码子之间的碱基配对的相互配对的相互 作用作用b、d、RF 的某种作用改变肽基转移酶的肽基的某种作用改变肽基转移酶的肽基转移特性转移特性 将将P位上的肽基转移到水分子上而并不形成位上的肽基转移到水分子上而并不形成新的肽键，导新的肽键，导 致肽基致肽基 tRNA的水解的水解 c、RF3 与与 GTP 结合为肽基转移及随后的结合为肽基转移及随后的核糖体释放提供能量核糖体释放提供能量 78整理ppt79整理ppt三、蛋白质合成抑制剂80整理ppt81整理ppt白喉毒素（diphtheria toxin)l对真核生物剧毒，实质是一种修饰酶，对真核生物的eEF2 起共价修饰作用，使其失活。l由于肿瘤细胞对白喉毒素比正常细胞更敏感，故用它与抗肿瘤细胞的特异抗原结合以消灭肿瘤细胞。82整理ppt四、蛋白质合成后的加工l N端端fMet或或Met的切除的切除l二硫键的形成二硫键的形成l特定氨基酸的修饰特定氨基酸的修饰l切除新生肽链中非功能片段切除新生肽链中非功能片段(信号肽等信号肽等)l蛋白质的剪接：内含肽和外显肽蛋白质的剪接：内含肽和外显肽83整理ppt 初级产物多肽链初级产物多肽链 天然蛋白质天然蛋白质残基的去除、残基的去除、AA侧链的修饰、多肽链侧链的修饰、多肽链折叠成二级、三级甚至四级结构折叠成二级、三级甚至四级结构前胰岛素原的加工前胰岛素原的加工84整理ppt第五节 翻译后转运机制85整理ppt86整理ppt一、蛋白质转运的意义(translocation)：l蛋白质的合成场所为胞浆中游离的核糖体或内质网上相对固定的核糖体。l细胞是分隔、分区的结构，所有的蛋白质在合成、加工完成后需要各就各位。l蛋白质的转运途径与其合成场所有关。87整理ppt二、翻译后转运机制：l细胞质中游离核糖体上合成的蛋白质，需要进入内质网等细胞器时，由2080个（主要带正电荷）氨基酸组成的信号肽，牵引穿过双层膜，在跨越内膜时被内膜蛋白切除，释放蛋白。l信号假说88整理ppt89整理ppt三、蛋白质降解是一个有序的过程三、蛋白质降解是一个有序的过程 l在大肠杆菌中，许多蛋白质的降解是通过一个依在大肠杆菌中，许多蛋白质的降解是通过一个依赖于赖于ATP的蛋白酶（称为的蛋白酶（称为Lon）来实现的。当细胞）来实现的。当细胞中存在有错误或半衰期很短的蛋白质时，该蛋白中存在有错误或半衰期很短的蛋白质时，该蛋白酶就被激活。每切除一个肽键要消耗两分子酶就被激活。每切除一个肽键要消耗两分子ATP。l在真核生物中，蛋白质的降解需要泛素在真核生物中，蛋白质的降解需要泛素Ubiquitin，一个有，一个有76个氨基酸残基组成极为保守的蛋白参个氨基酸残基组成极为保守的蛋白参与。与与。与Ubiquitin相连的蛋白将被送到一个依赖于相连的蛋白将被送到一个依赖于ATP的蛋白质降解系统（的蛋白质降解系统（Proteasome，Mr.1106）。）。90整理ppt朊病毒朊病毒 生物学特性 基因结构 复制过程朊病毒病 发 现 91整理pptl英国自1985年发现疯牛病到1996年，已确诊有16142头牛患病，数以万计的牛被扑杀、焚烧、处理，使英国蒙受巨大的经济损失,特别是英国连续出现12个青年患新型克雅氏病（new variant creutzfeldt-Jakob Disease nvCJD），人们怀疑该病是食用患疯牛病的牛肉引起的，在欧洲引起了极大的恐慌，疯牛病已成为欧洲严重的经济和政治问题。朊病毒发现朊病毒发现92整理ppt一、朊病毒（一、朊病毒（prionprion）的发现）的发现 人和哺乳动物的研究,发现疯牛病（BSE）、羊瘙痒病（SC）及人的纹状体脊髓变性病（CJD），脑软化病（GSS），库鲁病（kuru），致死性家族失眠症（FFI）等特别是导致神经元进行性退化变性均由于蛋白粒子造成的。朊病毒发现朊病毒发现93整理ppt 研究人员检测了羊搔痒病，发现感染因子可以通过滤器，有点像病毒，但与病毒不同，用福尔马林处理不能使之完全失活。进一步的研究发现这种物质对254nm的紫外线照射不敏感，而对237nm的紫外线敏感。Prusiner与其同事在1982年从仓鼠脑中得到羊搔痒病病原成分。其浓缩成分可被蛋白酶K，二乙酰焦碳酸、尿素、酚和SDS等失活，但不能被核酸酶或紫外线照射破坏。朊病毒发现朊病毒发现94整理ppt 所以Prusiner称之为Prion,意为蛋白性感染颗粒（Proteinaceous infectious particle）。这个成份中只含一种蛋白质，称为朊病毒蛋白（prion protein,PrP），并命名为朊病毒（Virino）。95整理ppt回目录页下一页生物学特性本质：传染性蛋白因子，主要成分是一种 蛋白水解酶抗性蛋白（PrPsc）生物学特性：l不具有病毒结构，未检出核酸；l对福尔马林、加热、电离辐射、紫外线抵抗力强；96整理ppt回目录页下一页PrPc：称之为朊蛋白，在人和动物细胞称之为朊蛋白，在人和动物细胞中普遍存在的朊病毒蛋白前体。为正常无中普遍存在的朊病毒蛋白前体。为正常无害的蛋白，由宿主细胞一条染色体上的一害的蛋白，由宿主细胞一条染色体上的一个基因产生，多数存在于神经元中。个基因产生，多数存在于神经元中。PrPsc：感染形式的朊病毒前体经蛋白酶感染形式的朊病毒前体经蛋白酶的酶切作用转化为的酶切作用转化为PrP2730，最后通过，最后通过纤维聚合自我成核作用，形成朊病毒蛋白。纤维聚合自我成核作用，形成朊病毒蛋白。朊病毒的蛋白结构朊病毒的蛋白结构PrPcPrPsc97整理ppt回目录页下一页朊病毒生物学特性朊病毒生物学特性一级结构一级结构二级结构二级结构三级结构三级结构四级结构四级结构蛋蛋白白质质的的四四级级结结构构98整理ppt朊病毒的生物学特性朊病毒的生物学特性 二级结构出现二级结构出现 转换转换，PrPc 螺旋含量达到螺旋含量达到42%42%，片层仅占片层仅占3%3%；PrPsc 螺旋含量降到螺旋含量降到30%30%，片层达到片层达到45%45%；PrPcPrPsc99整理ppt回目录页下一页朊病毒基因结构朊病毒基因结构人类定位于人类定位于2020号染色体，小鼠定位于号染色体，小鼠定位于2 2号染色体号染色体神经元神经元仓鼠的仓鼠的PrP基因基因100整理ppt回目录页下一页二、朊病毒的致病机制朊病毒的致病机制 朊病毒本身不能繁殖，它是通过胁迫朊病毒本身不能繁殖，它是通过胁迫PrPc畸变进行自我复制的。一个畸变进行自我复制的。一个PrPsc 分子击中一个分子击中一个PrPc，PrPc分子在分子在PrPsc的胁迫下结构发生改变，的胁迫下结构发生改变，形成形成PrPsc二聚体，接着二聚体，接着2个个PrPc在在2个个PrPsc的攻的攻击下，产生击下，产生4个个PrPsc，如此循环，当，如此循环，当PrPsc达到达到一定浓度后就会破坏神经元。一定浓度后就会破坏神经元。101整理ppt回目录页下一页朊病毒的生物学特性朊病毒的生物学特性PrPcPrPscPrPsc:朊病毒具有极强的生命力和感染力。含有朊病毒的10g鼠脑可使上亿只老鼠致病。朊病毒能抗甲醛、耐热，在120130度加热4小时，仍具有一定的感染力。102整理pptlThanks for your attention！103整理ppt