毛细管电泳.ppt
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1、第第20章章 毛细管电泳法毛细管电泳法(Capillary Electrophoresis CE)概述概述20.1 CE 的基本原理的基本原理20.2 CE 的分离模式的分离模式20.3 毛细管电泳仪毛细管电泳仪20.4 CE 在医药中的应用进展在医药中的应用进展 概述概述 电电泳泳:溶溶液液中中的的带带电电粒粒子子(离离子子、胶胶粒粒或或分分子子)在在电场中的定向迁移现象。电场中的定向迁移现象。物理化学现象。物理化学现象。毛毛细细管管电电泳泳(又又称称高高效效毛毛细细管管电电泳泳)(HPCE HPCE),是是一一类类以以毛毛细细管管为为分分离离通通道道、以以高高压压直直流流电电场场为为驱驱动
2、动力力的新型电泳分离技术。的新型电泳分离技术。包含电泳、色谱及其交叉内容。包含电泳、色谱及其交叉内容。电泳法电泳法(electrophoresiselectrophoresis)以电泳为基础的分离分)以电泳为基础的分离分析方法。析方法。电泳法的发展史电泳法的发展史(Phylogeny)(Phylogeny):电泳现象早在电泳现象早在1818世纪就被发现世纪就被发现。19091909年,年,L.MichaelisL.Michaelis提出提出“电泳电泳 (electrophoresiselectrophoresis)”)”这一术语,他的实验是用这一术语,他的实验是用于测定蛋白质的等电点。于测定蛋
3、白质的等电点。19371937年,年,瑞典科学家瑞典科学家A.Tiselius A.Tiselius 成功研制出界成功研制出界面电泳仪,并建立了移动界面电泳法,用于人血面电泳仪,并建立了移动界面电泳法,用于人血清蛋白的分离。清蛋白的分离。TiseliusTiselius于于4848年获诺贝尔化学奖。年获诺贝尔化学奖。花絮1937年,年,Tiselius(瑞典瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间,两端施以电压进行自由溶液电泳,第一次将人血清之间,两端施以电压进行自由溶液电泳,第一次将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和、球蛋白;
4、球蛋白;发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定;发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定;第一次的自由溶液电泳;第一台电泳仪;第一次的自由溶液电泳;第一台电泳仪;1948年,获诺贝尔化学奖;年,获诺贝尔化学奖;1.经典电泳技术经典电泳技术 利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方法和技术叫分析的方法和技术叫电泳法或电泳技术电泳法或电泳技术。经典电泳法经典电泳法自由界面电泳(无载体电泳)自由界面电泳(无载体电泳)区带电泳(有载体支持电泳)区带电泳(有载体支持电泳)界面电泳界面电泳 :在没有惰性支持物的液体接界面上:在没有惰性支持物的液体接界面
5、上进行的电泳。进行的电泳。缺点:缺点:对流较严重,组分不能完全分离,检测困难对流较严重,组分不能完全分离,检测困难区区带带电电泳泳:是是在在溶溶液液中中加加入入一一些些惰惰性性物物质质或或凝凝胶胶物物质质作作为为支支持持物物,泳泳动动物物质质在在支支持持物物间间隙隙中中移移动动的电泳方法。的电泳方法。避免对流的干扰。避免对流的干扰。纸电泳纸电泳醋酸纤维素电泳醋酸纤维素电泳淀粉凝胶电泳淀粉凝胶电泳琼脂糖电泳琼脂糖电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 常压电泳:常压电泳:电位梯度电位梯度 50V/cm 50V/cm高压电泳:高压电泳:电位梯度电位梯度 50V/cm 50V/cm影响因素:影响因
6、素:1.电荷效应2.溶液pH值3.离子强度和温度4.电渗5.载体性质和分子筛电泳速度电泳速度电场强度电场强度V/L(V/m)电泳速率电泳速率 传统电泳的缺陷:传统电泳的缺陷:(1)焦焦耳耳热热效效应应:电电流流通通过过电电泳泳介介质质而而产产生生的热效应。的热效应。使使电电泳泳分分离离介介质质温温度度分分布布不不均均匀匀,引引起起溶溶液液对对流流,从从而而导导致致区区带带展展宽宽,降降低低分分离离效效率率。焦焦耳耳热热效效应应随随电电场场强强度度的的增增大大而而迅迅速速加加剧剧,限限制了高电压的使用。制了高电压的使用。(2)无法在线检测,定量精度较差)无法在线检测,定量精度较差。2.2.高效毛
7、细管电泳技术高效毛细管电泳技术19811981年,年,Jorgenson和和Luckas,用,用7575 m m内径的内径的石英毛细管电泳分离了丹酰化氨基酸,柱效高石英毛细管电泳分离了丹酰化氨基酸,柱效高达达4040万万/m/m,使电泳技术发生了根本变革,迅速,使电泳技术发生了根本变革,迅速发展成为可与发展成为可与GCGC、HPLCHPLC相媲美的崭新的分离分相媲美的崭新的分离分析技术析技术高效毛细管电泳。高效毛细管电泳。毛细管电泳:毛细管电泳:使电泳过程在散热效率极高的毛细管内进行,使焦耳热效应减小,能使用高电压,全面改善分离质量和提高分析速度。总之,与经典电泳法比较,毛细管电泳法的特点总之
8、,与经典电泳法比较,毛细管电泳法的特点有四个:有四个:高效、快速、微量和自动化。高效、快速、微量和自动化。毛细管的使用使产生的热量能够较快散发,大毛细管的使用使产生的热量能够较快散发,大大减小了温度效应,大减小了温度效应,可以可以使用使用很高的很高的电压。电压。电压升高,电场推动力大,又可进一步使柱内电压升高,电场推动力大,又可进一步使柱内径变小,柱长增加,理论塔板数高达几十万块径变小,柱长增加,理论塔板数高达几十万块/米,米,特殊柱子可以达到数百万。特殊柱子可以达到数百万。高效毛细管电泳在技术上采取了三项重要改进:高效毛细管电泳在技术上采取了三项重要改进:一、采用了一、采用了50 50 m内
9、径的毛细管;内径的毛细管;二、采用了高达数千伏的高电压;二、采用了高达数千伏的高电压;三、实现了高灵敏度的在线检测。三、实现了高灵敏度的在线检测。19811981年年,JorgensonJorgenson和和LukacsLukacs 使使用用75m75m内内径径的的熔熔融融石石英英毛毛细细管管,电电泳泳分分离离氨氨基基酸酸和和肽肽,成成为为高高效效毛毛细细管管电电泳泳划划时时代代的的里里程程碑碑。至至此此,出出现现了了毛细管电泳技术。毛细管电泳技术。8080年年代代以以来来,诞诞生生了了很很多多新新的的毛毛细细管管电电泳泳方方法法,如毛细管凝胶电泳和毛细管等电聚焦电泳。如毛细管凝胶电泳和毛细管
10、等电聚焦电泳。8888年年商商品品化化HPCEHPCE问问世世,高高灵灵敏敏度度柱柱上上检检测测器器的的发发展展使使HPCEHPCE在在世世界界范范围围内内蓬蓬勃勃开开展展。HPCEHPCE已已成成为为电电泳领域发展最快的新分支。泳领域发展最快的新分支。毛细管电泳的发展毛细管电泳的发展 高效毛细管电泳法与高效液相色谱法比较高效毛细管电泳法与高效液相色谱法比较(1 1)分离过程:)分离过程:相同相同 HPCE HPCE 与与HPLC HPLC 都都是是一一种种液液相相分分离离分分析析技技术术。都都是是差差速速迁迁移移过过程程,可可用用相相同同的的理理论论来来描描述述,如如保保留留值值、塔板理论和
11、速率理论等。塔板理论和速率理论等。(2 2)分离原理:)分离原理:不同(不同(驱动力不同驱动力不同)HPCEHPCE:带带电电粒粒子子在在电电场场中中发发生生定定向向移移动动,依依据据粒粒子子所所带带电电荷荷数数、形形状状、离离解解度度等等不不同同所所产产生生的的差差速速迁迁移而分离。移而分离。HPLCHPLC:不同组分在两相中的分配系数不同而分离。不同组分在两相中的分配系数不同而分离。(4 4)应用:)应用:二者相互补充二者相互补充 HPCEHPCE在在生生物物大大分分子子分分离离方方面面,在在分分析析速速度度和和效效率率、样样品品和和试试剂剂用用量量方方面面有有优优势势,但但在在样样品品制
12、制备备和和定定性、定量重复性等方面不及性、定量重复性等方面不及HPLCHPLC。(3 3)仪器流程:)仪器流程:基本相同基本相同 都都包包括括进进样样装装置置、分分离离柱柱、检检测测器器和和数数据据记记录录处处理理等部分。等部分。1.1.分离模式多:分离模式多:2.2.分析速度快、分离效率高分析速度快、分离效率高 在在3.1min内分离内分离36种无机及有机阴离子,种无机及有机阴离子,4.1min内分离内分离了了24种阳离子;种阳离子;分离柱效:分离柱效:105107/m理论塔板数;理论塔板数;3.3.操作方便、消耗少操作方便、消耗少 进样量极少(进样量极少(纳升)纳升),水介质中进行;,水介
13、质中进行;4.仪器简单、易自动化仪器简单、易自动化 电源、毛细管、检测器、溶液瓶电源、毛细管、检测器、溶液瓶5.5.应用范围极广应用范围极广 有机物、无机物、生物、中性分子;生物大分子等;有机物、无机物、生物、中性分子;生物大分子等;分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等;分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等;小结:小结:高效毛细管电泳法的特点高效毛细管电泳法的特点 (多、快、好、省多、快、好、省)20.1 20.1 毛细管电泳的基本原理毛细管电泳的基本原理一、一、电泳和电泳淌度电泳和电泳淌度二、二、电渗和电渗率电渗和电渗率三、表观淌度三、表观淌度四、四、分离效率和谱带展宽分
14、离效率和谱带展宽五、五、分离度分离度 介质的介电常数介质的介电常数 介质的粘度介质的粘度 i粒子的 Zeta 电势,近似正比于 Z/M2/3 Z 为净电荷,M 为摩尔质量。电泳的速度电泳的速度 uep 可表示为:可表示为:ep 电泳淌度,电泳淌度,单位电场下的电泳速度。单位电场下的电泳速度。空心毛细管柱中一个粒子的空心毛细管柱中一个粒子的淌度淌度近似表示为:近似表示为:一一、电泳和电泳淌度、电泳和电泳淌度与介质性质与介质性质有关有关与粒子性质有关:与粒子性质有关:表面电荷和粒子质量的大小表面电荷和粒子质量的大小有效淌度:有效淌度:在实际溶液中,考虑离子活度系数、溶在实际溶液中,考虑离子活度系数
15、、溶质分子的离解程度均对粒子的淌度有影响,这时的质分子的离解程度均对粒子的淌度有影响,这时的淌度称为淌度称为有效淌度有效淌度。i 样品分子的第样品分子的第 i i 级电离度级电离度 i 活度系数或其它平衡离解度活度系数或其它平衡离解度总之,总之,粒子的迁移速度除与粒子的迁移速度除与电场强度电场强度和和介质的特性介质的特性有关外,有关外,还与粒子的离解度、电荷数及其大小和形状有关。还与粒子的离解度、电荷数及其大小和形状有关。不同的带电粒子电泳速度不同,可以实现分离不同的带电粒子电泳速度不同,可以实现分离二、电渗和电渗率二、电渗和电渗率电电渗渗(electroosmotic):在在电电场场作作用用
16、下下,液液体体相相对对带带电电的的固固体体支支持持介介质质移移动动的的现现象象,又又称称电电渗渗(流)(流)EOF。石石英英毛毛细细管管表表面面含含有有许许多多硅硅醇醇基基(SiOHSiOH),在在一一定定的的条条件件下下可可离离解解使使表面带有负电荷。表面带有负电荷。毛细管中的电渗流的形成毛细管中的电渗流的形成双电层抗衡离子机机理理:当当在在毛毛细细管管两两端端加加有有电电场场时时,双双电电层层内内靠靠近近管管壁壁的的稠稠密密层层中中可可迁迁移移阳阳离离子子向向阴阴极极移移动动。由由于于离离子子是是被被水水化化的的,因因此此,带带动动管管中中的的液液体体也也随随迁移着一起匀速向阴极移动,形成
17、电渗流。迁移着一起匀速向阴极移动,形成电渗流。总之,总之,毛细管中的电渗流是毛细管内壁表面电毛细管中的电渗流是毛细管内壁表面电荷所引起的管内液体的整体流动。荷所引起的管内液体的整体流动。电电渗渗流流的的特特点点:具具有有一一定定流流型型,其其电电渗渗驱驱动动力力沿沿毛毛细细管管均均匀匀分分布布,所所以以电电渗渗速速度度的的径向分布几乎是均匀的。径向分布几乎是均匀的。eo电渗率,电渗率,单位电场下的电渗流的线速度单位电场下的电渗流的线速度 介质的介电常数介质的介电常数 介质的粘度介质的粘度 管壁的管壁的 Zeta Zeta 电势,即电势,即双双电层到电层到管壁很近的地方之间的管壁很近的地方之间的
18、电位差。电位差。总总之之,Zeta Zeta 电电势势越越大大,介介电电常常数数越越大大,粘粘度度越越小小,电渗流越大。电渗流越大。在在电电场场作作用用下下,电电泳泳和和电电渗渗同同时时存存在在,电电渗渗流流速速度度是电泳的是电泳的 5 5 7 7 倍。倍。电渗的速度可以表示为:电渗的速度可以表示为:硅醇基阴离子石英毛细管柱内壁的双电层结构图石英毛细管柱内壁的双电层结构图双双电电层层电电势势表面电势表面电势 0Stern电势电势 d电动电势电动电势 双电层模型双电层模型电渗流的控制:电渗流的控制:电渗流是毛细管电泳的基本操作要素,为了优化电渗流是毛细管电泳的基本操作要素,为了优化分离,有必要对
19、它进行控制。分离,有必要对它进行控制。电渗流的控制要求对毛细管表面及缓冲液的粘度电渗流的控制要求对毛细管表面及缓冲液的粘度进行调节。进行调节。(1 1)电场强度)电场强度(2 2)缓冲溶液的)缓冲溶液的pHpH(影响管壁带电情况)(影响管壁带电情况)(3 3)缓冲溶液的浓度和离子强度(影响)缓冲溶液的浓度和离子强度(影响Zeta Zeta 电电势)势)三、三、表观淌度表观淌度在在毛毛细细管管电电泳泳中中同同时时存存在在电电泳泳流流和和电电渗渗流流,所所以以带带电电粒粒子子在在电电场场中中的的迁迁移移速速度度由由两两者者同同时时决决定定,可可表表示为:示为:uap 表观迁移速度表观迁移速度 ap
20、 表观淌度表观淌度注:注:一般情况下一般情况下,uos os uefef中性分子中性分子 阳离子阳离子 阴离子阴离子电渗电渗流流四、四、分离效率和谱带展宽分离效率和谱带展宽1.柱效参数柱效参数理论塔板数和塔板高度理论塔板数和塔板高度理论塔板数:理论塔板数:塔板高度:塔板高度:Ld 进样口到检测器之间的距离进样口到检测器之间的距离t tm m 迁移时间迁移时间,W W1/21/2 时间半峰宽时间半峰宽影响柱效的因素:影响柱效的因素:(1 1)n n 与与 E E 成正比,成正比,E E 越大,柱效越高。越大,柱效越高。(2 2)n n 与与溶溶质质的的扩扩散散系系数数 (D)成成反反比比,D越越
21、小小的分子柱效越高。的分子柱效越高。毛细管电泳的速率方程:毛细管电泳的速率方程:理论塔板数:理论塔板数:溶质的扩散系数溶质的扩散系数只有纵只有纵向扩散向扩散项项2.2.引起带展宽的因素引起带展宽的因素电渗的流型:电渗的流型:呈塞状扁平流型呈塞状扁平流型 扁平流型是毛细管电泳获得高分离度的重要原因扁平流型是毛细管电泳获得高分离度的重要原因之一,是理想状态。之一,是理想状态。(1 1)扩散)扩散扩扩散散系系数数由由溶溶质质本本身身的的性性质质决决定定,随随分分子子量量的的增增加而降低。分子越大,加而降低。分子越大,D D 越小。越小。因此,毛细管电泳特别适合分离生物大分子。因此,毛细管电泳特别适合
22、分离生物大分子。另另外外,凡凡是是能能影影响响溶溶质质扩扩散散的的因因素素都都会会影影响响谱谱带带宽度。宽度。(2 2)自热(焦耳热)自热(焦耳热)焦耳热通过毛细管壁向周围环境散逸时,焦耳热通过毛细管壁向周围环境散逸时,在毛细在毛细管内形成管内形成径向温度梯度径向温度梯度(管壁温度(管壁温度 管轴心温度)管轴心温度)表:毛细管壁温度和中心到壁的温差表:毛细管壁温度和中心到壁的温差 径向温度梯度导致缓冲溶液的径向粘度梯度径向温度梯度导致缓冲溶液的径向粘度梯度 ,引起电泳,引起电泳淌度改变,淌度改变,导致离子迁移速度的径向不均匀分布,破坏导致离子迁移速度的径向不均匀分布,破坏了区带的扁平流轮廓,导
23、致区带展宽,柱效降低。了区带的扁平流轮廓,导致区带展宽,柱效降低。焦耳热和温度梯度的控制焦耳热和温度梯度的控制焦焦耳耳热热的的大大小小与与毛毛细细管管尺尺寸寸、缓缓冲冲液液电电导导及及电电场场强度有关。强度有关。操作电压:操作电压:电压越高,焦耳热越严重。电压越高,焦耳热越严重。柱内径:柱内径:是影响焦耳热的一个重要因素。内径越是影响焦耳热的一个重要因素。内径越小,焦耳热的影响越小。通常毛细管电泳采用尽小,焦耳热的影响越小。通常毛细管电泳采用尽可能小的柱内径。可能小的柱内径。缓冲溶液的浓度:缓冲溶液的浓度:浓度增加,焦耳热增加浓度增加,焦耳热增加。目前常采用内径为目前常采用内径为 25 257
24、5 75 m m 的毛细管柱的毛细管柱采用外管壁涂层技术采用外管壁涂层技术。Knox方程:方程:Edc1/31500E电场强度,电场强度,d d管内径,管内径,c c介质浓度介质浓度满足上式方程,自热影响较小。满足上式方程,自热影响较小。当当E=50kV/m,E=50kV/m,c c=0.01mol/L=0.01mol/L时,时,d140m即能即能满足上述方程满足上述方程 。(3)(3)吸附吸附毛细管电泳中的吸附作用主要指毛细管管壁对被毛细管电泳中的吸附作用主要指毛细管管壁对被分离物质粒子的作用。分离物质粒子的作用。主要原因:主要原因:阳离子溶质和带负电的管壁离子相互作用;疏水阳离子溶质和带负
25、电的管壁离子相互作用;疏水作用。作用。吸附作用与毛细管表面积与体积之比有关。吸附作用与毛细管表面积与体积之比有关。内径越细,吸附越严重。内径越细,吸附越严重。五、五、分离度分离度分离度:分离度:将淌度相近的组分分开的能力。将淌度相近的组分分开的能力。n 理论塔板数理论塔板数 u/u 两组分的相对迁移速度差两组分的相对迁移速度差定义式:定义式:根据根据 Gidding 方程,分辨率方程,分辨率 R 定义为:定义为:对上面的公式处理,可得:由公式可见:由公式可见:R 并非随操作电压线性增加,而是并非随操作电压线性增加,而是与操作电压的平方根成正比。与操作电压的平方根成正比。操作电压的增加受到焦耳热
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