外泌体-未来的医学研究和应用新方向.ppt
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1、Exosomes:Ourfuturetarget!2021/3/29 星期一1简介外泌体最早发现于体外培养的绵羊红细胞上清液中细胞主动分泌的囊泡样小体大小较为均一,直径为40100纳米密度1.101.18g/ml2021/3/29 星期一22021/3/29 星期一32021/3/29 星期一42021/3/29 星期一5细胞外泌体携带多种蛋白质、mRNA、miRNA,参与细胞通讯、细胞迁移、血管新生和肿瘤细胞生长等过程并有可能成为药物的天然载体,应用于临床治疗。Thry C是建立外泌体提取分离鉴定金标准的泰斗(Thry et al,2006)。在Cell发表了一篇综述,文中着重讨论了EV对癌
2、症转移作用的最新发现,下面就是她的综述内容2021/3/29 星期一6ExosomesExosomes还是还是EV?EV?Thry C提出应该是 exosomes“而不是”exosome”(Thry,et al.2014)因为Exosome还含有另一个含义:外切酶体复合物,具有RNase活性。分离的产物若没有进一步证明它的细胞内来源,应定义为混合的小EVExtracellular Vesicles,即胞外囊泡。来自多泡内体多泡内体或MVB的才是exosomes,可检测囊泡是否含内体标志蛋白证明,如CD63。Multivesicular bodies,MVB=MVE Multivesicular
3、 endosomes 因此,这些exosomes的功能可能是广义EV的,也可能是真正的exosomes。下面Thry C的综述中使用广义的EV指没有专门鉴定过大小的囊泡,使用小EV指小于200nm的小囊泡。2021/3/29 星期一72021/3/29 星期一8EVEV帮助癌细胞长出帮助癌细胞长出“腿腿”?1.肿瘤来源的EV对受体细胞有不同的作用。在原发性肿瘤位点,EV能稳定细胞突起,增强癌细胞运动能力。EV通过细胞外基质(ECM)局部沉积,促进定向的持续迁移,例如含有纤连蛋白(Fibronectin)的小EV。2.包含金属蛋白酶(Metalloproteinases)的EV也可以直接参与EC
4、M重构(Remodeling),使特化的细胞突起具有降解能力,也就是侵入性伪足(Invadopodia)。ECM重构帮助肿瘤细胞在组织之间迁移。2021/3/29 星期一92021/3/29 星期一103.EV可促进肿瘤基质细胞的分化或募集,如纤维母细胞(Fibroblasts)和骨髓来源细胞(Bonemarrow-derived cells,BMDC)。反过来,周围纤维母细胞分泌的EV可以增强肿瘤细胞迁移能力及耐药性。4.小EV还能进入循环,从原发肿瘤到达远端位点。小EV的堆积可能增加血管通透性,EV可以进入远端组织,诱导ECM重构、募集BMDC以及后来的肿瘤细胞,制造转移前微环境(Pre-
5、metastatic niche)。2021/3/29 星期一11体内分析体内分析EVEV转移的方法转移的方法将标签添加到分泌的EV里I.将荧光蛋白基因融合到棕榈酰化(Palmitoylation)序列,标记全细胞膜,通过mRNA的新荧光我们可以跟踪结合或内化了EV的细胞II.膜结合荧光素酶蛋白可以分析体内发光细胞,这样就能捕获结合EV的荧光素酶蛋白或荧光素酶mRNAIII.用CRE重组酶,检测EV内的mRNA2021/3/29 星期一122021/3/29 星期一13EVEV帮助小帮助小RNARNA转运?转运?miRNA分泌进小EV,运输进靶细胞并发挥功能,直接调控miRNA靶标。Pegte
6、l et al,2010,发现小EV转运EB病毒miRNA到邻近未感染的细胞,抑制靶基因。除了EV包裹的miRNA,miRNA起的作用也有可能是其他EV组分在靶细胞表达内源miRNA引起的。如何明确上述两种情况?转运的miRNA是外源基因组编码的,如病毒的(Pegtel et al,2010)或寄生虫的(Buck et al,2014),又或者受体细胞是小鼠的,并没有所研究的miRNA(Alexander et al,2015)。2021/3/29 星期一14EVEV与免疫与免疫最 近报道发现肿瘤微环境中EV的RNA有着一段特殊的序列(Boelenset al,2014):它带有5-triph
7、osphate末端,通过RIG-I感应器被受体细胞基质识别,诱导干扰素应答,跟病毒感染类似。这种应答也参与癌症 细胞对放疗或化疗的应答。小EV与包膜病毒有相似作用?何种表面分子协助受体细胞膜融合RNA或小分子内含物到细胞 质呢?这个问题有待探索。2021/3/29 星期一15外泌体分离和检测外泌体分离和检测2021/3/29 星期一161.分离到目前为止,仍没有一种提取方法能同时保证外泌体的含量、纯度以及生物活性。2021/3/29 星期一171.1离心法最常用的方法。收集细胞培养液以后依次在300g、2000g、10000g离心去除细胞碎片和大分子蛋白质,最后100000g离心得到外泌体。得
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