DBS13∕ 001-2015 食品安全地方标准 食品中诺如病毒检测.pdf
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1、2015-04-23 发布2015-05-01 实施DBS13河北省地方标准DBS13/0012015食品安全地方标准食品中诺如病毒检测河北省卫生和计划生育委员会河北省卫生和计划生育委员会发布发布DBS13/0012015I前言本标准按GB/T1.1-2009规定的格式编写。本标准的附录A为规范性附录。本标准由河北省卫生和计划生育委员会归口。本标准于2015年4月23日首次发布。DBS13/00120151食品安全地方标准食品中诺如病毒检测1范围本标准规定了贝类、生食叶类蔬菜和包装饮用水等食品中诺如病毒普通RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测方法。本标准适用于贝类、生食叶类蔬菜和包装饮用水等
2、食品中型和型诺如病毒的检测。2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。诺如病毒norovirus诺如病毒属于人类杯状病毒科,诺如病毒属,是一组形态相似、抗原性略有不同的病毒颗粒。诺如病毒直径约为 26nm35nm,无包膜,表面粗糙,球形,呈二十面体对称。诺如病毒基因组是单股正链 RNA,组成长约 7kb7.5kb,电镜下缺乏显著的形态学特征,负染色电镜照片显示,诺如病毒是具有典型的羽状边缘、表面有凹痕的小圆状结构病毒。诺如病毒共可分为 个基因型,其中感染人的主要是型和型。3设备和材料3.1电子天平:感量 0.1g。3.2组织匀浆器或其他可以破碎样品的工具。3.3普通冰箱:28。3.4超低温冰箱:
3、-805。3.5高速冷冻离心机:最大离心力大于 15000g。3.6恒温水浴箱或金属浴:3765。3.7PCR 扩增仪。3.8实时荧光 PCR 扩增仪。3.9电泳仪。3.10凝胶成像系统。3.11震荡混匀器。3.12电热干燥箱。DBS13/001201523.13pH 计。3.14水过滤系统。3.15微量可调移液器:1L10L、10L100L、100L1000L。3.16洗耳球或电动移液器。3.17无 RNA 酶的玻璃容器、微量加样器吸头、无菌 50mL 离心管、无菌 1.5mL 离心管和 PCR 管。3.18无 RNA 酶的一次性移液管:10mL、25mL。3.19混合硝酸纤维素膜:孔径 0
4、.22m。4试剂除有特殊说明外,所有实验用试剂均为分析纯。4.1无 RNA 酶的超纯水:见附录 A.1。4.2甘氨酸缓冲液:见附录 A.2。4.35X PEG8000 溶液:见附录 A.3。4.42.5mol/L 氯化镁(MgCl2)溶液:见附录 A.4。4.5牛肉膏-甘氨酸洗脱液:见附录 A.5。4.6氯仿。4.71mol/L 盐酸溶液。4.81mol/L 氢氧化钠溶液。4.9病毒 RNA 提取试剂盒。4.10Taq DNA 聚合酶:-20保存,避免反复冻融。4.11逆转录酶:-20保存,避免反复冻融。4.12RNA 酶抑制剂:-20保存,避免反复冻融。4.13dNTPs:含 dCTP、dG
5、TP、dATP、dTTP 各 10mmol/L。4.14引物和探针:使用浓度为 25mol/L,-20保存,引物和探针序列见表 1 和表 2。表 1普通 RT-PCR 检测引物检测的病毒类群引物序列片段大小/bpGI 和 GII正向引物 F:5-ATACCACTATGATGCAGATTA-3326反向引物 R:5-TCATCATCACCATAGAAAGAG-3DBS13/00120153表 2实时荧光 RT-PCR 检测引物和探针检测的病毒类群引物和探针序列片段大小/bpGI正向引物 F:5-CGCTGGATGCGNTTCCAT-3反向引物 R:5-CCTTAGACGCCATCATCATTTA
6、C-3探针:5-FAM-TGGACAGGAGAYCGCRATCT-TAMRA-386GII正向引物 F:5-ATGTTCAGRTGGATGAGRTTCTCWGA-3反向引物 R:5-TCGACGCCATCTTCATTCACA-3探针:5-FAM-AGCACGTGGGAGGGCGATCG-TAMRA-3894.151TAE:见附录 A.6。4.16分子量标记:100bp1000bp。4.17诺如病毒阳性对照。4.18诺如病毒阴性对照。4.19溴化乙锭(EB)溶液(10g/L):见附录 A.7。4.2010上样缓冲液:见附录 A.8。4.21含 0.5g/mL 溴化乙锭(或 5%GoldView)
7、的 1.5%琼脂糖凝胶:见附录 A.9。5检测程序诺如病毒检测程序见图。DBS13/00120154图1诺如病毒检测程序6检测步骤6.1样品的运输与保存运输过程中保持样品温度在 05。实验室接到样品后应尽快进行检测。如果暂时不能检测应将样品保存于-80冰箱中,避免样品反复冻融。6.2样品处理和病毒富集6.2.1贝类6.2.1.1取样:首先用灭菌蒸馏水将贝壳表面的污泥清洗干净,打开贝壳后,倒掉腔内的液体,使用无菌的剪刀和镊子取贝类消化腺组织。6.2.1.2按无菌操作取 5g 消化腺组织,在组织匀浆器中高速匀浆 3min 或切碎成 2mm3以下的小块,放入 50mL 离心管中,加入 35mL 甘氨
8、酸缓冲液(样品重量与缓冲液体积之比为 1:7),37孵育 30minDBS13/00120155或室温下剧烈振荡 10min。4,10000g 离心 30min。6.2.1.3转移上清液至另一个 50mL 离心管中,加入 10mL 或更多氯仿,充分振荡,放置 10min,4,10000g 离心 30min。如上清较浑浊,可重复用氯仿再抽提一次。6.2.1.4转移上清至另一个 50mL 离心管中,用 1mol/L 盐酸调节 pH 至 7.00.5,加入 0.25 倍体积的 PEG8000 溶液(PEG 终浓度为 8%),上下颠倒离心管以充分混匀。6.2.1.5冰上放置至少 1h 或 4放置过夜。
9、4,10000g 离心 5min。弃去上清,保留沉淀。6.2.1.6加入 200L 无 RNA 酶的超纯水,60加热 5min 充分溶解沉淀。4,10000g 离心 3min,取上清,得到病毒粗提产物。6.2.2生食叶类蔬菜6.2.2.1使用无菌的剪刀和镊子将 25g 生食叶类蔬菜剪成约 2.5cm2.5cm2.5cm 的小块,装入 50mL离心管中,加入 40mL 甘氨酸缓冲液,37孵育 30min 或室温下剧烈震荡 10min,4,10000g 离心 30min。6.2.2.2转移上清至另一个 50mL 离心管中,用 1mol/L 盐酸溶液调节 pH 至 7.00.5,加入 0.25 倍体
10、积的 PEG8000 溶液,上下颠倒离心管以充分混匀。6.2.2.3冰上放置至少 1h 或 4放置过夜。4,10000g 离心 5 min。弃去上清,保留沉淀。6.2.2.4加入 200L 无 RNA 酶的超纯水,60加热 5min 充分溶解沉淀。4,10000g 离心 3min,取上清,得到病毒粗提产物。6.2.3包装饮用水6.2.3.1500mL 水样中加入 10mL 的 2.5mol/L 氯化镁溶液,使其终浓度达到 0.05mol/L;用 1mol/L盐酸调节水样 pH 至 3.00.5。6.2.3.2采用真空抽滤使之通过孔径为 0.22m 的混合硝酸纤维素膜(混浊度较大的污水,需预先澄
11、清),然后用 10mL 牛肉膏-甘氨酸洗脱液(pH9.5)震荡洗脱滤膜 2030min。6.2.3.3去除滤膜,用 1mol/L 盐酸溶液调节洗脱液 pH 至 7.00.5,向洗脱液中加入 0.25 倍体积的PEG8000 溶液,上下颠倒离心管以充分混匀。6.2.3.4将离心管及样液一起放在冰上放置至少 1h 或 4放置过夜。4,10000g 离心 5min。弃去上清,保留沉淀。6.2.3.5加入 200L 无 RNA 酶的超纯水,60加热 5min 充分溶解沉淀。4,10000g 离心 3min,取上清,得到病毒粗提产物。6.3病毒 RNA 的提取和纯化使用病毒 RNA 提取试剂盒进行 RN
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