流式细胞仪分析技术及应用.doc
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4、分析; 高灵敏度、高分辨率、高重复性、高分选纯度; 可分析大量细胞; 速度快: 5000-10000个细胞/秒; 统计学意义:提供细胞群体的均值和分布情况; 分选感兴趣的细胞:血细胞、骨髓、组织培养细胞等。 流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪,是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质(如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等)进行快速测量并可分类收集的高技术。流式细胞仪分为三大类: 一类为台式机(临床型): BD FACSCalibur流式细胞仪特点: 仪器的光路调节系统固定,自动化程度高,操作简便,易学易掌握。 两激光配置:488nm 633nm
5、检测参数:四荧光参数 两个散射光参数 分析型流式细胞仪 应用:细胞分析检测FCM图片台式机 第二类为大型机(科研型) 特点:分辨率高,可快速将所感兴趣的细胞分选出来,并可以将单个细胞或指定个数的细胞分选到特定的培养孔或培养板上,同时可选配多种波长和类型的激光器,适用于更广泛更灵活的科学研究应用。FCM图片大型机 第三类为新型流式细胞仪: 随着激光技术的不断发展,仪器选用2-4 根激光管,最多检测十三个荧光参数,加上散射光信号可达到15 个参数的同时分析。并且可以实现高速分选,速度达到50,000 个/秒,并可进行遥控分选,能够满足多种科学研究的要求。BDFACSAria流式细胞仪: 高速分析分
6、选流式细胞仪 高速分析 高速分选 3根激光: 488nm 633nm 375nm结合特制高性能石英杯流动室 应用:细胞分析分选 sp细胞检测 一般分为5 部分: 流动室及液流驱动系统; 激光光源及光束成形系统; 光学系统; 信号检测、存贮、显示、分析系统; 细胞分选系统。 流式细胞仪构造模式图 光学测量台电子控制台数据采集、储存和计算机处理。 光学测量台:完成光学信号测量和转换 电子控制台:将转换的电脉冲信号进行整形、放大并模数转换成数据信号数字信号最后送入电子计算机里储存处理 输出直方图、二维点图、等高图、三维图以及其他统计结果。 由样本和鞘液组成 待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料标记的单
7、抗对其染色 受清洁气体压力 从样品管进入流动室形成样本流 鞘液(PBS或生理盐水):主要作用是包裹样本流的周围,样品流在鞘液的环包下形成流体力学聚焦,包裹的细胞排列成单行,以每秒5000个-10000个细胞,每秒10米速度流动室喷出,保证每个细胞通过激光照射区的时间相等,从而得到准确的细胞荧光信息。流动室与液流驱动系统 细胞流和鞘液流的驱动一般采用加正压的方法,流速和压力的关系服从Bernoulli 方程: P=(1/2)PV (勿略高度的变化) 真空泵产生压缩空气,通过鞘液压力调节器加在鞘液上,一个恒定的压力(压力的大小由工厂设定),这样鞘液以均速运动流过流动室,在整个系统运行中流速是不变的
8、。 改变样本的进样速率开关,可提高采样分析的速度。 激光光源:采用气冷式氩离子激光器 分色反光镜:反射长/短波长,通过短/长波长 光束成形器:两十字交叉放置的透镜 透镜组:形成平行光,除去室内光 滤片:长通、短通、带通 光电倍增管(PMT):FSC, SSC(散射光), FL1, FL2, FL3, FL4(荧光)流式细胞仪构造模式图激光光源与光束成形系统 大多采用氩离子气体激光器: 激光(Laser)是一种相干光源,提供单波长、高强度及稳定性高的光照,是细胞微弱荧光快速分析的理想光源,由于细胞快速流动,每个细胞经过光照区的时间仅为1 微秒左右,每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱,与
9、被照射的时间和激发光的强度有关,因此细胞必须达到足够的光照强度。 激光光束在达到流动室前,先经过透镜,将其聚焦,形成几何尺寸约为2266m 即短轴稍大于细胞直径的光斑(见图1-2-6)。 这种椭圆形光斑激光能量分布属正态分布,为保证样品中细胞受到的光照强度一致。 激光光束与细胞液流呈90角方向照射,细胞产生散射光和荧光。激光光源及光束成形系统 主要光学原件是滤光片(Filter),主要分成3 类: 1、长通滤片:(long-pass filter, LP) :LP500滤片允许500m 以上光通过,而500m 以下光吸收或返回。 2、短通滤片(short-pass filtr, SP) :与长
10、通滤片相反,如SP500 滤片允许500m 以下光通过,500m 以上光吸收或返回。 3、带通滤片(band-pass filter, BP) :带通滤片可允许相当窄的一波长范围内光通过,一般滤片上有两个数,一个为允许通过波长的中心值,另一为允许通过光的波段范围。 如BP500 表示其允许通过波长范围为75m-525m。长通滤片 短通滤片 带通滤片 主要由计算机及其软件分析系统组成散射光信号示意图前向散射光(forward scatter, FSC):激光束照射细胞时,光以相对轴较小角度(0.510)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性,信号强弱与细胞体积大小成正比。 当激光光束与细胞
11、正交时,一般产生两种荧光信号: 一种是细胞自发荧光:细胞自身在激光照射下,发出微弱荧光信号; 另一种是经过特异荧光素标记细胞后,受激发照射得到的荧光信号,由于 90o 方向的散射光信号较弱,容易分离出荧光信号,因此此方向上放置必要的光学元件(滤光片、双色分光镜等),可以获取荧光信号。 通过收集两种以上不同波长的荧光信号FL1 、FL2进行检测和定量分析,了解所研究细胞参数的存在与定量,反映生物颗粒表面和内部的各种情况。 荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生,发射的荧光波长与激发光波长不同,可以显示不同的荧光颜色如红色、绿色、蓝色等。 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色,通过
12、波长选择通透性滤片,可将不同波长的散射光和荧光信号区分开,送入不同的光电倍增管(PMT)。 一般有两类放大器:线性放大器和对数放大器荧光染料的特性 常配置的激光器波长为488nm 通常采用染料: 碘化丙锭 (propidium iodide,PI)、 PI 630nm 藻红蛋白(phycoerythrin,PE)、PE 575nm 异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC) FITC 525nm PE-CY5 等。 633nm激光器常用染料有 APC APC-Cy 激发波长 发射波长 FITC 488nm 525nm PE 488nm
13、 575nm PE-TR 488nm 615nm PE-Cy5.5 488nm 667nm PE-Cy7 488nm 767nm (以上五种荧光染料可在Coulter XL 或BD Calibur 或Partec,PAS,Cyflow,Cytomation,Moflo机型上使用) APC 633nm 660nm APC-Cy 633nm 767nm (以上二种染料可在装有双激光的流式胞仪上使用)荧光信号示意图以激发光光源波长488nm为例示意图: 荧光信号的线性测量与对数测量: 主要由电子线路来完成 当携带荧光素的细胞与激光正交时,受激发发出荧光,经过滤光片分离不同波长的光信号分别到达不同的光
14、电倍增管(PMT),PMT 将光信号转换成电信号。 电信号输入到放大器放大,放大器分两类: 线性放大和对数放大 线性放大器:即放大器的输出与输入是线性关系,细胞DNA 含量、RNA 含量、总蛋白质含量等的测量一般选用线性放大测量。 荧光信号的面积和宽度 所谓荧光信号的面积:采用对荧光光通量进行积分测量,一般对DNA 含量测量时,采用面积(FL2-A),这是因为荧光脉冲的面积比荧光脉冲的高度更能准确反映DNA 的含量,当形状差异较大,而DNA 含量相等的两个细胞,得到的荧光脉冲高度是不等的。经过对荧光信号积分后,所得到的信号值就相等。 荧光信号的宽度(如FL2-W)常用来区分双联体细胞,由于DN
15、A 样本极易聚集,当两个G1 期细胞粘连在一起时,其测量到的DNA 荧光信号(FL2-A)与G2M 期细胞相等,这样得到的测量数据G2M 期细胞比率会增高,影响测量准确性。通过设”门”(gate)方法,将双联体细胞排除。其原理是双联体细胞所得到的荧光宽度信号(FL2-W)要比单个G2M 细胞大,因此设”门”后才能得到真正的DNA 含量分布曲线和细胞周期。不过通过荧光强度的高度峰和面积峰也可做同样分析。 光谱重叠的校正 当细胞携带两种荧光素(如PE 和FITC)受激光激发而发射出两种不同波长的荧光时,理论上可选择滤片使每种荧光仅被相应的检测器检测到,而不会检测到另一种荧光。 要克服这种误差的最有
16、效方法是使用荧光补偿电路,利用标准已知样品或荧光小球,可合理设置荧光信号的补偿值。 各荧光素的激发及发射波长的峰值,但实际上各荧光素的激发或发射波长是正态或偏态曲线,即有很宽的范围。如下图,为FTIC,PE 的发射波长,可以看到两者的发射波长均为偏态分布,FITC 受激后多数将光源转变为525nm 左右的光;PE 多数将其转变为575nm 左右的光。 同时使用两种荧光染料,就会出现发射光谱相互叠加的现象。 分选收集装置: 微管 1275mm 15ml管 微孔板分选 可以用24/96/384/1500微孔板进行微孔分选。 检测指标: 阳性百分率 绝对计数 平均荧光强度 分选速度:单位时间内分选的
17、细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。一般要求分选速度至少达5 000 个秒左右,以保证被分选细胞的生物学活性不受影响。 分选纯度:被分选出的细胞所占的百分比,分选纯度与仪器的精密度直接相关,与实验设计的选择密切相关,可达到99%。 分选收获率:实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。 分选得率:从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量,再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。 参数:FSC,SSC,FL 数据文件为二进制文件,缺乏直观性,数据的显示常用以下几种数据显示方式: 单参数直方图 、双参数散点图 、二维等高图 、假三维等高图 、三参数散点图 设门
18、分析技术 目前FCM 数据存贮的方式:采用列表排队(list mode)方式 目前FCM 所采用的都是多参数指标,荧光参数标记物如是4 个,采用list mode 方式可大量地节约内存和磁盘容量。当一个细胞被测4 个参数,那么获取10000 个细胞,所占容量为410000 个(字或双字)。同时当只检测1 个参数时(如DNA),可灵活的关闭其它3 个参数,节省3/4 的空间数据的显示通常有一维直方图、二维点图、等高线图、密度图等几种。FSC:反映颗粒的大小SSC:反映颗粒的内部结构复杂程度FL:反映颗粒被染上的荧光数量多少 单参数直方图 双参数直方图:点图 二维等高图 假三维等高图 三参数直方图
19、 多参数分析 由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成,反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度(FSC、SSC、FL1、FL2)四个参数的任何一个值。其单位是信道,横坐标可以是线性的,也可以是对数的,纵坐标一般是细胞数。 如图表示细胞DNA单参数直方图,横坐标表示荧光信号强度,纵坐标代表所检测的细胞数。直方图 直方图(Distribution Histogram) 横坐标代表荧光信号或散射光信号相对强度,单位是道数,可以是线性或对数坐标。 纵坐标一般是细胞数。 双参数直方图:纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数,根据这两个参数就可以
20、确定细胞在图上的表达位置。 双参数信号通常采用对数信号,最常用的是点密图,在图中,每个点代表一个细胞,点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。 在二维图中,任选FSC、SSC、FL1、FL2 中二个参数作为X 轴、Y轴,在二维图上每个点代表一个细胞,可以区分细胞性质不同的群体; X 坐标为该细胞一参数的相对含量 Y 坐标为该细胞另一参数的含量。 在双参数图形中可以将各细胞亚群区分开,同时可获得细胞相关的重要信息。 下图1为FSC 和SSC 组成的点图,x 轴反映SSC的强弱,y 轴反映FSC 的强弱根据细胞大小和结构的不同,外周血白细胞在本图上被明显地区分为淋巴细胞、单核细胞
21、和中性粒细胞从左到右可以区分为三个细胞亚群淋巴细胞、单核细胞及中性粒细胞统计数据。 下图2是通过设门分析(gating analysis)得到的FL1 和FL2 散点图,设门可以是单参数设门,也可以是双参数设门,通过设”门”可以调出其它参数的相关信息,被调出的信息同样也可以是单参数和双参数。 图1-2-10(左)就是通过细胞的前向角和侧向角散射光双参数点阵图,设”门”圈出标本中的淋巴细胞群体,再调出免疫荧光的散点图。3 .散点图 散点图(Dot Plot) X坐标为该细胞一参数相对含量,Y坐标为该细胞另一参数的含量,可以将细胞亚群分开。 由类似地图上的等高线组成,其本质也是双参数直方图。 等高
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