DNA的Feulgen染色法.ppt

DNA的的Feulgen染色和细胞有染色和细胞有丝分裂相的观察丝分裂相的观察.DNA是主要的遗传物质，主要分布在核的染色质或有丝是主要的遗传物质，主要分布在核的染色质或有丝分裂过程中出现的染色体内。自从分裂过程中出现的染色体内。自从1924年年Feulgen等人建等人建立了立了DNA-Feulgen染色方法以来染色方法以来,至今这种方法仍是至今这种方法仍是DNA定量测定的主要染色方法之一。定量测定的主要染色方法之一。一、实验目的一、实验目的1 1 了解了解FeulgenFeulgen反应的基本原理。反应的基本原理。2 2 熟悉传统细胞化学实验的基本实验技能和操作方法。熟悉传统细胞化学实验的基本实验技能和操作方法。3 3 掌握细胞分裂各期的主要特点。掌握细胞分裂各期的主要特点。.二、实验原理二、实验原理 DNA经弱酸（经弱酸（1mol/LHCL）水解，）水解，其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键打开，使脱氧核糖的一端形成游离打开，使脱氧核糖的一端形成游离的醛基，这些醛基在原位与的醛基，这些醛基在原位与Schiff试剂（无色品红亚硫酸溶液）反应，试剂（无色品红亚硫酸溶液）反应，形成紫红色的化合物，使细胞内含形成紫红色的化合物，使细胞内含有有DNA的部位呈紫红色阳性反应。的部位呈紫红色阳性反应。紫红色的产生，是由于反应产物的分子内含有醌基，醌基紫红色的产生，是由于反应产物的分子内含有醌基，醌基是一个发色团，所以具有颜色。对照组预先用热三氯醋酸是一个发色团，所以具有颜色。对照组预先用热三氯醋酸或或DNA酶处理，抽提去细胞中的酶处理，抽提去细胞中的DNA而得到阴性反应，而得到阴性反应，从而证明了从而证明了Feulgen反应的专一性。反应的专一性。.三、试剂三、试剂1.Carnoy1.Carnoy固定液固定液 ：3 3份份95%95%酒精加入酒精加入1 1份冰醋酸。份冰醋酸。2.1mol/LHCL 2.1mol/LHCL：准确量取：准确量取86.2ml86.2ml浓盐酸（比重浓盐酸（比重1.181.18）加入到）加入到93.8ml93.8ml蒸馏水中。蒸馏水中。3.Schiff3.Schiff试剂：称试剂：称1g1g碱性品红于碱性品红于200ml200ml煮沸的重蒸馏水中，煮沸的重蒸馏水中，5 5分钟后断电使其冷却至分钟后断电使其冷却至55555050，过滤到一个棕色的试剂，过滤到一个棕色的试剂瓶中，加入瓶中，加入1N1NHClHCl20ml20ml，继续冷却至，继续冷却至2525，加入，加入1g1g偏偏亚硫酸氢钠，摇动瓶子使其溶解。密闭瓶口，置黑暗低温亚硫酸氢钠，摇动瓶子使其溶解。密闭瓶口，置黑暗低温处或冰箱内（处或冰箱内（44左右），左右），18182424小时后检查，试剂如透小时后检查，试剂如透明无色或呈浅黄色时即可使用，这就是明无色或呈浅黄色时即可使用，这就是SchiffSchiff试剂溶液。如试剂溶液。如有不同程度的红色未褪，可加入有不同程度的红色未褪，可加入1g1g活性炭，强烈震荡一分活性炭，强烈震荡一分钟，仍在低温下静置过夜，然后用滤纸过滤后使用。密封钟，仍在低温下静置过夜，然后用滤纸过滤后使用。密封瓶口，包以黑纸，在瓶口，包以黑纸，在55以下冰箱内可以保存半年。以下冰箱内可以保存半年。.4.4.亚硫酸水溶液亚硫酸水溶液(漂白液漂白液)：在：在200ml200ml蒸馏水中，加入蒸馏水中，加入10ml10ml1N1NHClHCl和和10ml10ml10%10%偏亚硫酸氢钠水溶液（或偏亚硫酸氢钠水溶液（或1.0g1.0g固体）。此液在临用前配制。固体）。此液在临用前配制。否则会因否则会因SO2SO2的的逸出的的逸出而失效。而失效。5.5%5.5%三氯乙酸三氯乙酸6.0.5%6.0.5%固绿酒精溶液（固绿酒精溶液（95%95%的酒精溶解）的酒精溶解）.四、实验材料及实验器材四、实验材料及实验器材1.材料材料Carnoy液固定的洋葱根尖液固定的洋葱根尖2.实验器材实验器材显微镜、恒温水浴锅、镊子、解剖针、剪刀、显微镜、恒温水浴锅、镊子、解剖针、剪刀、载玻片、盖玻片、吸水纸、青霉素瓶、吸管、载玻片、盖玻片、吸水纸、青霉素瓶、吸管、烧杯、量筒。烧杯、量筒。.五、实验方法和步骤五、实验方法和步骤（一）材料准备（一）材料准备取洋葱头若干，剥皮后置于盛取洋葱头若干，剥皮后置于盛有水的培养皿内使其长出新根。待根尖长有水的培养皿内使其长出新根。待根尖长1cm1cm时，时，剪下根尖固定在剪下根尖固定在CarnoyCarnoy固定液内、保存备用。固定液内、保存备用。（二）水解（二）水解实验时，取出预先准备好的洋葱根实验时，取出预先准备好的洋葱根尖，用自来水漂洗后，置于尖，用自来水漂洗后，置于3ml 1mol/L3ml 1mol/LHClHCl中，中，在在600.5600.5恒温水浴锅中水解恒温水浴锅中水解8-158-15分钟。然后吸分钟。然后吸去热去热1mol/L HCl1mol/L HCl，再用自来水将根尖洗，再用自来水将根尖洗3 3次。次。水解是本实验成败的关键之一。重要的是温度，水解是本实验成败的关键之一。重要的是温度，应保持在应保持在600.5600.5之间。如果温度过高或时间过之间。如果温度过高或时间过长，造成水解过度，醣与醛基之间的键被破坏，长，造成水解过度，醣与醛基之间的键被破坏，醛基流失到水解液中；反之，不能出现潜在的醛醛基流失到水解液中；反之，不能出现潜在的醛基，都不能呈现颜色反应。基，都不能呈现颜色反应。.预处理：切取长约5mm的植物根尖，加入Carnoy固定液固定2小时以上。样品可以转入70%酒精中长期保存。.将根尖放入1mol/L的盐酸中，60水浴，恒温条件下解离815min。.（三）染色（三）染色吸净水分，加入吸净水分，加入Schiff试剂避光染色试剂避光染色40min60min，用亚硫酸水漂洗，用亚硫酸水漂洗23次，每次次，每次5min，然后经自来水流水冲洗干净后准备压片。，然后经自来水流水冲洗干净后准备压片。（四）压片法（四）压片法取一根尖置于载玻片上，用切下生长取一根尖置于载玻片上，用切下生长区部位（染成紫红色），加盖玻片，用拇指或铅区部位（染成紫红色），加盖玻片，用拇指或铅笔的橡皮头轻压使细胞分散均匀，镜检。笔的橡皮头轻压使细胞分散均匀，镜检。（五）对照组预先用（五）对照组预先用5%三氯醋酸（三氯醋酸（90）处理）处理15min，然后再依次进行实验步骤（二），然后再依次进行实验步骤（二）（三）（三）（四）。（四）。.染色后倒出染色后倒出Schiff试剂试剂，亚硫酸水漂洗亚硫酸水漂洗23次，次，每次每次35min，自来水自来水漂洗干净，盖上盖玻片。漂洗干净，盖上盖玻片。.用镊子或铅笔轻轻敲打，使根尖细胞分散开。.六、有丝分裂各期观察六、有丝分裂各期观察洋葱根尖压片的观察洋葱根尖压片的观察首先在低倍镜下，区分根尖的分生组织区及延长组首先在低倍镜下，区分根尖的分生组织区及延长组织区的细胞，然后，在高倍镜下，观察细胞核的形织区的细胞，然后，在高倍镜下，观察细胞核的形态，注意在你的片子上，是否有有丝分裂细胞，如态，注意在你的片子上，是否有有丝分裂细胞，如有，你能找到细胞分裂期的几个阶段，其特征如何有，你能找到细胞分裂期的几个阶段，其特征如何？（可参照附录）？（可参照附录）.实验结果.附录：植物细胞分裂的几个时期。附录：植物细胞分裂的几个时期。细胞周期分为间期及分裂期，按照有细胞周期分为间期及分裂期，按照有无核膜，核仁、染色体，以及染色体无核膜，核仁、染色体，以及染色体形态与分布位置的变化，细胞有丝分形态与分布位置的变化，细胞有丝分裂又分为前期、中期、后期和末期四裂又分为前期、中期、后期和末期四个阶段。现将各期特点简述如下，个阶段。现将各期特点简述如下，（1）前期：此期的染色质螺旋盘绕）前期：此期的染色质螺旋盘绕成一定数目的细而长的染色丝，此即成一定数目的细而长的染色丝，此即染色体。染色体先是分散于核液中，染色体。染色体先是分散于核液中，以后，逐渐向核膜移动，在此时，核以后，逐渐向核膜移动，在此时，核仁逐渐消失，核膜溶解。仁逐渐消失，核膜溶解。（2）中期：染色体进一步盘绕，变）中期：染色体进一步盘绕，变短变粗，在细胞的中央（即赤道板）短变粗，在细胞的中央（即赤道板）规则地排列成行，仔细观察，可看到规则地排列成行，仔细观察，可看到染色体两侧的纺锤丝。染色体两侧的纺锤丝。.（3）后期：姊妹染色体分别向细胞两极移动，染色体达到）后期：姊妹染色体分别向细胞两极移动，染色体达到两极时染色体紧缩成团，染色体的轮廓逐渐变得不清楚，两极时染色体紧缩成团，染色体的轮廓逐渐变得不清楚，细胞质中间部位（细胞的赤道板）形成细胞板。细胞质中间部位（细胞的赤道板）形成细胞板。（4）末期：盘绕变粗的染色体又伸展开，此时，核仁、核）末期：盘绕变粗的染色体又伸展开，此时，核仁、核膜又重新出现。膜又重新出现。此外，间期细胞的细胞核有下述特点：核膜清楚，核内此外，间期细胞的细胞核有下述特点：核膜清楚，核内结构均匀，除异染色质外，可见结构均匀，除异染色质外，可见12个着色较深的核仁。个着色较深的核仁。而在进入细胞分裂期的细胞核，一般均大于间期细胞核。而在进入细胞分裂期的细胞核，一般均大于间期细胞核。.植物细胞的细胞质分裂.七、七、Feulgen方法应注意的几个问题：方法应注意的几个问题：1.对照压片的制做对照压片的制做进行进行Feulgen反应时反应时,一般要做一对照压片以便一般要做一对照压片以便说明实验结果的真实性。对照压片的材料应在酸说明实验结果的真实性。对照压片的材料应在酸解前预先用解前预先用5%三氯醋酸（三氯醋酸（90）处理）处理15min，然，然后再依次进行酸解、染色和压片等。后再依次进行酸解、染色和压片等。.2.固定剂的选择固定剂的选择以前很多人认为，选用的固定剂不应含有醛基或含有以前很多人认为，选用的固定剂不应含有醛基或含有氧化剂。后来发现含醛基或氧化剂的固定剂对反应的专一氧化剂。后来发现含醛基或氧化剂的固定剂对反应的专一性并没有影响。实践证明，一切好的组织学固定剂均适用性并没有影响。实践证明，一切好的组织学固定剂均适用于于Feulgen反应。如反应。如Bhampy固定剂、固定剂、Helly固定剂、固定剂、Flemming固定剂、固定剂、OsO4固定剂、固定剂、Carnoy固定剂、固定剂、zenker固定剂和固定剂和Bouin-Aller固定剂。固定剂。但在上述固定剂中，以但在上述固定剂中，以OsO4和和Carnoy效果较好，效果较好，OsO4(1%或或0.5%)是是Feulgen反应的理想固定剂，只是因反应的理想固定剂，只是因OsO4价钱较贵，故一般多采用价钱较贵，故一般多采用Carnoy固定液。固定液。.3.水解时间水解时间Feulgen反应通常用稀酸进行水解，但水解的时间一定要适反应通常用稀酸进行水解，但水解的时间一定要适当。如水解时间不够当。如水解时间不够,反应就会变弱；如水解时间过长。或反应就会变弱；如水解时间过长。或水解地过于剧烈，则脱氧核糖也易掉下来，反应也会减弱。水解地过于剧烈，则脱氧核糖也易掉下来，反应也会减弱。如用如用Carnoy固定液固定的材料，水解时间一般在固定液固定的材料，水解时间一般在815min之间。但是水解时间长短也要视标本的类型之间。但是水解时间长短也要视标本的类型(如厚薄等如厚薄等)、固、固定剂的性质以及酸的浓度而定。定剂的性质以及酸的浓度而定。.4.Schiff试剂的作用试剂的作用Feulgen反应成功与否的一个非常关键的因素，就是反应成功与否的一个非常关键的因素，就是schiff试剂的质量。有一大类试剂均称为碱性品红，它们试剂的质量。有一大类试剂均称为碱性品红，它们实际上是由几种产品分别组成的。因此只能选用注明实际上是由几种产品分别组成的。因此只能选用注明“DNA染色反应用染色反应用”的碱性品红才行。此外，的碱性品红才行。此外，Schiff试剂的试剂的配制方法也可影响配制方法也可影响DNA的染色反应。的染色反应。配好的配好的Schiff试剂须试剂须在在55以下冰箱内避光保存。以下冰箱内避光保存。.5.漂白液的重要性：漂白液的重要性：漂洗时，所用的亚硫酸水，最好在每次实验前临时配制，漂洗时，所用的亚硫酸水，最好在每次实验前临时配制，以便保持较浓的以便保持较浓的SO2。6.操作过程中，用镊子镊取根尖的生长区部位，切勿夹取根操作过程中，用镊子镊取根尖的生长区部位，切勿夹取根冠部位。冠部位。注意事项注意事项不要把染液滴加到桌面上不要把染液滴加到桌面上.八八 、思考题、思考题1.1.说明说明Feulgen Feulgen 反应中设立的对照组的必要性。反应中设立的对照组的必要性。2.Schiff2.Schiff试剂的主要作用是什么试剂的主要作用是什么?3.3.酸水解的作用是什么？酸水解的作用是什么？.