DNA的Feulgen染色法.ppt
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1、DNA的的Feulgen染色和细胞有染色和细胞有丝分裂相的观察丝分裂相的观察.DNA是主要的遗传物质,主要分布在核的染色质或有丝是主要的遗传物质,主要分布在核的染色质或有丝分裂过程中出现的染色体内。自从分裂过程中出现的染色体内。自从1924年年Feulgen等人建等人建立了立了DNA-Feulgen染色方法以来染色方法以来,至今这种方法仍是至今这种方法仍是DNA定量测定的主要染色方法之一。定量测定的主要染色方法之一。一、实验目的一、实验目的1 1 了解了解FeulgenFeulgen反应的基本原理。反应的基本原理。2 2 熟悉传统细胞化学实验的基本实验技能和操作方法。熟悉传统细胞化学实验的基本
2、实验技能和操作方法。3 3 掌握细胞分裂各期的主要特点。掌握细胞分裂各期的主要特点。.二、实验原理二、实验原理 DNA经弱酸(经弱酸(1mol/LHCL)水解,)水解,其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键打开,使脱氧核糖的一端形成游离打开,使脱氧核糖的一端形成游离的醛基,这些醛基在原位与的醛基,这些醛基在原位与Schiff试剂(无色品红亚硫酸溶液)反应,试剂(无色品红亚硫酸溶液)反应,形成紫红色的化合物,使细胞内含形成紫红色的化合物,使细胞内含有有DNA的部位呈紫红色阳性反应。的部位呈紫红色阳性反应。紫红色的产生,是由于反应产物的分子内含有醌基,醌基紫红色的产生,是由于
3、反应产物的分子内含有醌基,醌基是一个发色团,所以具有颜色。对照组预先用热三氯醋酸是一个发色团,所以具有颜色。对照组预先用热三氯醋酸或或DNA酶处理,抽提去细胞中的酶处理,抽提去细胞中的DNA而得到阴性反应,而得到阴性反应,从而证明了从而证明了Feulgen反应的专一性。反应的专一性。.三、试剂三、试剂1.Carnoy1.Carnoy固定液固定液 :3 3份份95%95%酒精加入酒精加入1 1份冰醋酸。份冰醋酸。2.1mol/LHCL 2.1mol/LHCL:准确量取:准确量取86.2ml86.2ml浓盐酸(比重浓盐酸(比重1.181.18)加入到)加入到93.8ml93.8ml蒸馏水中。蒸馏水
4、中。3.Schiff3.Schiff试剂:称试剂:称1g1g碱性品红于碱性品红于200ml200ml煮沸的重蒸馏水中,煮沸的重蒸馏水中,5 5分钟后断电使其冷却至分钟后断电使其冷却至55555050,过滤到一个棕色的试剂,过滤到一个棕色的试剂瓶中,加入瓶中,加入1N1NHClHCl20ml20ml,继续冷却至,继续冷却至2525,加入,加入1g1g偏偏亚硫酸氢钠,摇动瓶子使其溶解。密闭瓶口,置黑暗低温亚硫酸氢钠,摇动瓶子使其溶解。密闭瓶口,置黑暗低温处或冰箱内(处或冰箱内(44左右),左右),18182424小时后检查,试剂如透小时后检查,试剂如透明无色或呈浅黄色时即可使用,这就是明无色或呈浅
5、黄色时即可使用,这就是SchiffSchiff试剂溶液。如试剂溶液。如有不同程度的红色未褪,可加入有不同程度的红色未褪,可加入1g1g活性炭,强烈震荡一分活性炭,强烈震荡一分钟,仍在低温下静置过夜,然后用滤纸过滤后使用。密封钟,仍在低温下静置过夜,然后用滤纸过滤后使用。密封瓶口,包以黑纸,在瓶口,包以黑纸,在55以下冰箱内可以保存半年。以下冰箱内可以保存半年。.4.4.亚硫酸水溶液亚硫酸水溶液(漂白液漂白液):在:在200ml200ml蒸馏水中,加入蒸馏水中,加入10ml10ml1N1NHClHCl和和10ml10ml10%10%偏亚硫酸氢钠水溶液(或偏亚硫酸氢钠水溶液(或1.0g1.0g固体
6、)。此液在临用前配制。固体)。此液在临用前配制。否则会因否则会因SO2SO2的的逸出的的逸出而失效。而失效。5.5%5.5%三氯乙酸三氯乙酸6.0.5%6.0.5%固绿酒精溶液(固绿酒精溶液(95%95%的酒精溶解)的酒精溶解).四、实验材料及实验器材四、实验材料及实验器材1.材料材料Carnoy液固定的洋葱根尖液固定的洋葱根尖2.实验器材实验器材显微镜、恒温水浴锅、镊子、解剖针、剪刀、显微镜、恒温水浴锅、镊子、解剖针、剪刀、载玻片、盖玻片、吸水纸、青霉素瓶、吸管、载玻片、盖玻片、吸水纸、青霉素瓶、吸管、烧杯、量筒。烧杯、量筒。.五、实验方法和步骤五、实验方法和步骤(一)材料准备(一)材料准备
7、取洋葱头若干,剥皮后置于盛取洋葱头若干,剥皮后置于盛有水的培养皿内使其长出新根。待根尖长有水的培养皿内使其长出新根。待根尖长1cm1cm时,时,剪下根尖固定在剪下根尖固定在CarnoyCarnoy固定液内、保存备用。固定液内、保存备用。(二)水解(二)水解实验时,取出预先准备好的洋葱根实验时,取出预先准备好的洋葱根尖,用自来水漂洗后,置于尖,用自来水漂洗后,置于3ml 1mol/L3ml 1mol/LHClHCl中,中,在在600.5600.5恒温水浴锅中水解恒温水浴锅中水解8-158-15分钟。然后吸分钟。然后吸去热去热1mol/L HCl1mol/L HCl,再用自来水将根尖洗,再用自来水
8、将根尖洗3 3次。次。水解是本实验成败的关键之一。重要的是温度,水解是本实验成败的关键之一。重要的是温度,应保持在应保持在600.5600.5之间。如果温度过高或时间过之间。如果温度过高或时间过长,造成水解过度,醣与醛基之间的键被破坏,长,造成水解过度,醣与醛基之间的键被破坏,醛基流失到水解液中;反之,不能出现潜在的醛醛基流失到水解液中;反之,不能出现潜在的醛基,都不能呈现颜色反应。基,都不能呈现颜色反应。.预处理:切取长约5mm的植物根尖,加入Carnoy固定液固定2小时以上。样品可以转入70%酒精中长期保存。.将根尖放入1mol/L的盐酸中,60水浴,恒温条件下解离815min。.(三)染
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