昆虫杆状病毒载体研究.ppt
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1、昆虫杆状病毒表达系统昆虫杆状病毒表达系统高遄高遄高遄高遄 生物化学与分子生物生物化学与分子生物生物化学与分子生物生物化学与分子生物 21204222120422原核细胞系统原核细胞系统l大大肠杆菌杆菌细胞胞操作简便周期短、收益大表达产物稳定相对分子质量有限不能对表达产物进行一些翻译后加工、修饰体外基因体外基因表达系统表达系统真核细胞真核细胞系统系统 l哺乳哺乳动物物细胞胞l酵母酵母细胞胞l昆虫昆虫细胞(胞(杆状杆状病毒表达系病毒表达系统)独特特性前言前言高表达高表达低成本低成本安全性高安全性高大大规模生模生产前言前言v昆虫杆状病毒表达系昆虫杆状病毒表达系统是目前国内外十分推崇的是目前国内外十分
2、推崇的真核表达真核表达系系统。利用杆状病毒。利用杆状病毒结构基因中构基因中多角体蛋白多角体蛋白的的强启启动子子构构建的表达建的表达载体,可使很多真核目的基因得到有效甚至高水体,可使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表达。平的表达。v具有具有高效表达高效表达、基因克隆容量大基因克隆容量大、重重组病毒易于病毒易于筛选、安安全性高全性高、且有完、且有完备的的翻翻译后加工修后加工修饰系系统等特点,等特点,现已成已成为基因工程四大表达系基因工程四大表达系统之一。之一。v利用利用该表达系表达系统获得重得重组蛋白可用于蛋白可用于药物开物开发、疫苗生、疫苗生产、生物生物杀虫虫剂等多个等多个领域。据文献域。据
3、文献统计,已有,已有1000 余种外余种外源基因在昆虫杆状病毒表达系源基因在昆虫杆状病毒表达系统中得到了成功地表达,其中得到了成功地表达,其中中约有有95%的外源重的外源重组蛋白能蛋白能够被正确的被正确的转译后加工修后加工修饰,具有与天然蛋白相同的生物活性。,具有与天然蛋白相同的生物活性。昆虫杆状病毒昆虫杆状病毒表达系统表达系统2 2.杆状病毒载体表达系统的特点杆状病毒载体表达系统的特点杆状病毒载体表达系统的特点杆状病毒载体表达系统的特点3.3.昆虫杆状病毒表达系统的应用昆虫杆状病毒表达系统的应用昆虫杆状病毒表达系统的应用昆虫杆状病毒表达系统的应用1.1.昆虫杆状病毒表达系统的构成昆虫杆状病毒
4、表达系统的构成昆虫杆状病毒表达系统的构成昆虫杆状病毒表达系统的构成4.4.参考文献参考文献参考文献参考文献1.昆虫杆状病毒表达系统的构成昆虫杆状病毒表达系统的构成1.1 杆状病毒载体杆状病毒载体1.2 昆虫细胞宿主昆虫细胞宿主表达体系表达体系1.昆虫杆状病毒表达系统的构成昆虫杆状病毒表达系统的构成表达表达过程程1.将外源目的基因将外源目的基因插入插入到启到启动子下游子下游2.与杆状病毒与杆状病毒重重组,获得重得重组病毒病毒3.将重将重组的病毒的病毒纯化化4.感染感染昆虫昆虫细胞或虫体胞或虫体5.外源基因随着病毒的复制而外源基因随着病毒的复制而获得得表达表达1.1 杆状病毒载体杆状病毒载体v1.
5、1.1杆状病毒杆状病毒简介介v杆状病毒是研究杆状病毒是研究细胞分子生物学的重要工具,同胞分子生物学的重要工具,同时也是外源基也是外源基因在昆虫因在昆虫细胞中表达的胞中表达的载体。杆状病毒只来源于体。杆状病毒只来源于无脊椎无脊椎动物物,已已发现600多种多种杆状病毒,其中杆状病毒,其中仅有不到有不到20 种种进行了分子生行了分子生物学研究。物学研究。v杆状病毒的基因杆状病毒的基因组为单一一闭合合环状双状双链DNA 分子,分子,大小大小为80 160kb,其基因,其基因组可在昆虫可在昆虫细胞核复制和胞核复制和转录。DNA 复制后复制后组装在杆状病毒的核衣内,后者具有装在杆状病毒的核衣内,后者具有较
6、大的柔大的柔韧性,可性,可容容纳较大片段的外源大片段的外源DNA 插入,因此是表达大片段插入,因此是表达大片段DNA 的理的理想想载体。其中体。其中,用作外源基因表达用作外源基因表达载体的杆状病毒,目前体的杆状病毒,目前仅限限于于核型多角体病毒核型多角体病毒(nuclear poly hedrosis virus,NPV)。1.1 杆状病毒载体杆状病毒载体v现已知基因已知基因组全序列的杆状病毒全序列的杆状病毒仅有有7 种种:苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)家蚕核多角体病毒(BmNPV)黄杉毒蛾多核衣壳核多角体病毒(OpMNPV)舞毒蛾多核衣壳核多角体病毒(LdMNPV)甜菜夜蛾多核衣
7、壳核多角体病毒(SeMNPV)棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)斜纹夜蛾核型多角体病毒(SpltMNPV)1.1 杆状病毒载体杆状病毒载体vAcMNPV 是昆虫杆状病毒表达系是昆虫杆状病毒表达系统中最常用的中最常用的载体,基因表达分体,基因表达分为4 个个阶段段:立即早期基因表达立即早期基因表达、早期基因表达早期基因表达、晚期基因表达晚期基因表达和和极晚期基因表极晚期基因表达达。早于早于DNA 复制复制 病毒病毒DNA 合成合成v多角体蛋白多角体蛋白是形成包含体的主要成分,感染后期在是形成包含体的主要成分,感染后期在细胞中的胞中的积累可高达累可高达30%50%,是病毒复制,是病毒复制非必需成分
8、非必需成分,但,但对病毒粒子却有病毒粒子却有保保护作用作用,可使之保持可使之保持稳定和感染能力。定和感染能力。vP10 蛋白蛋白为另一另一类高效表达的极晚期蛋白,也是一高效表达的极晚期蛋白,也是一类病毒复制病毒复制非必需成非必需成分分,可在,可在细胞中形成胞中形成纤维状物状物质,可能与,可能与细胞溶解胞溶解有关。有关。理想的外源基理想的外源基因插入位点因插入位点1.1 杆状病毒载体杆状病毒载体v载体重体重组原理:原理是人原理:原理是人为将杆状病毒多角体蛋白两翼序列的将杆状病毒多角体蛋白两翼序列的同源序列引入含外源基因的同源序列引入含外源基因的质粒粒载体中,通体中,通过同源重同源重组方式来方式来
9、实现外源基因外源基因对病毒多角体蛋白基因的替病毒多角体蛋白基因的替换。v由于杆状病毒分子由于杆状病毒分子质量量约为134kb,不能利用,不能利用多克隆位点多克隆位点(酶切切连接)接)进行基因重行基因重组,只能利用杆状病毒和,只能利用杆状病毒和带有外源基有外源基因的因的质粒粒载体体进行行共共转染染(转移移载体的介体的介导)。)。多克隆位点:DNA载体序列上人工合成的一段序列,含有多个限制内切酶识别位点。能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。共转染:物理上不相连的基因被整合到同一整合序列并在同一转染细胞内表达的现象。1.1 杆状病毒载体杆状病毒载体1.1.2杆状病毒杆状病毒载体的重体的重组
10、将极晚期基因将极晚期基因(如多角体基因及其如多角体基因及其边界区界区)克隆克隆入入细菌的菌的质粒粒中中消除消除其其编码区和不合适的区和不合适的酶切位点切位点保留保留其其5c端端对高效表达必需的高效表达必需的调控区控区在下游在下游引入引入合适的合适的酶切位点供外源基因的插入,即得到切位点供外源基因的插入,即得到转移移载体体。将要表达的外源基因将要表达的外源基因插入插入其启其启动子下游子下游与野生型与野生型AcNPV DNA 共共转染染昆虫昆虫细胞胞通通过两两侧同源同源边界区在体内界区在体内发生生同源重同源重组,使多角体蛋白基因,使多角体蛋白基因被外源基因取代。被外源基因取代。1.1 杆状病毒载体
11、杆状病毒载体1.1.3杆状病毒杆状病毒载体的体的筛选v由于由于多角体基因多角体基因被破坏,被破坏,则不能形成多角体。不能形成多角体。这种表型在种表型在进行行常常规空斑空斑测定定时,可同野生型具有多角体的病毒空斑区,可同野生型具有多角体的病毒空斑区别开来,开来,这就是最初的就是最初的筛选重重组病毒的方式。病毒的方式。v由于重由于重组效率效率较低低(0.1%1%),表型差,表型差别不不显著,著,应用上有一定的困用上有一定的困难。1.1 杆状病毒载体杆状病毒载体1.1.3杆状病毒杆状病毒载体的体的筛选v为此,此,经过不断探索,在重不断探索,在重组杆状病毒的杆状病毒的筛选与与鉴定方面取定方面取得了很大
12、改得了很大改进。v具体方法有以下几种:具体方法有以下几种:1.-半乳糖苷半乳糖苷酶的的蓝白白筛选2.体外体外酶促定位重促定位重组3.Bacmid4.TK 基因基因5.Neo 基因基因BacmidvLuckow 等开等开发。快速、高效。快速、高效产生重生重组AcMNPV 病毒。取病毒。取杆状病毒杆状病毒(baculovirus)和和质粒粒(plasmid)的英文字的英文字头字尾命名字尾命名为Bacmid,即杆状病毒,即杆状病毒质粒之意。粒之意。v根据根据F因子因子载体原理,用体原理,用类似于酵母体内重似于酵母体内重组的方法,的方法,构建构建了了一种新杆状病毒穿梭一种新杆状病毒穿梭载体体Bacmi
13、d。该载体可像体可像质粒一粒一样在在大大肠杆菌中生杆菌中生长,又,又对鳞翅目昆虫翅目昆虫细胞具有感染性。胞具有感染性。vBacmid 含有含有F因子复制子因子复制子(可在大可在大肠杆菌中复制杆菌中复制)、卡那霉、卡那霉素抗性基因及素抗性基因及Tn7 转座位点座位点attTn7。v转移移载体中,外源基因体中,外源基因置于置于杆状病毒启杆状病毒启动子之下子之下,两端分两端分别为Tn7的左右端。以其的左右端。以其转化化含含Bacmid的的E.coli菌株,由菌株,由辅助助质粒提供反式作用粒提供反式作用发生生转座座,而将外源基因,而将外源基因转到到Bacmid的的attTn7位置。位置。Bacmidv
14、在在Bacmid 中,外源基因被核多角体启中,外源基因被核多角体启动子控制,子控制,并包含了多种抗性基因及并包含了多种抗性基因及LacZ 缺失缺失标记,极大地方,极大地方便了重便了重组病毒的病毒的筛选及及鉴定。定。这种重种重组了外源基因的了外源基因的Bacmid转染的昆虫染的昆虫细胞,可得到胞,可得到100%阳性重阳性重组病毒病毒。v操作操作简单方便,只需方便,只需1 周即可完成重周即可完成重组病毒病毒载体的构体的构建。建。Bacmidv由于我国有养蚕由于我国有养蚕业,还可在可在AcMNPV Bac-to-Bac表达系表达系统的基的基础上上进行改造,构建能行改造,构建能够应用于家蚕的用于家蚕的
15、BmNPV Bac-to-Bac 表达系表达系统,这将大大减少将大大减少传统昆虫杆状病毒昆虫杆状病毒表达系表达系统表达外源重表达外源重组蛋白所需蛋白所需时间,极大地提高了工作效,极大地提高了工作效率。率。还能能够解决培养昆虫解决培养昆虫细胞成本高,胞成本高,难于于规模化生模化生产等等问题。v重重组率率100%、操作、操作简便、便、1 周完成重周完成重组、全部操作都在、全部操作都在细菌中菌中进行,取名行,取名为Bac-to-Bac 表达系表达系统1.2 昆虫昆虫细胞宿主胞宿主v昆虫昆虫细胞在生物学、医学、胞在生物学、医学、农业等等领域中被作域中被作为非常重要的研非常重要的研究工具。究工具。v目前
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