第十五章基因重组与基因工程ChapterGene.ppt

第十五章第十五章 基因工程基因工程 Chapter 15 Genetic Engineering 基因重组基因重组(gene recombination)(gene recombination)是指是指DNADNA片段在细胞内、细胞间，甚至在不同物种片段在细胞内、细胞间，甚至在不同物种之间进行交换，交换后的片段仍然具有复制和表达之间进行交换，交换后的片段仍然具有复制和表达的功能的功能。基因工程基因工程(genetic(genetic engineeringengineering）是指采用人工方法将不同来是指采用人工方法将不同来源的源的DNADNA进行重组，并将重组后的进行重组，并将重组后的DNADNA引入宿主细胞引入宿主细胞中进行增殖或表达的过程，从而改变生物特性或创中进行增殖或表达的过程，从而改变生物特性或创造新的生物类型的技术。造新的生物类型的技术。整合整合:外来外来DNADNA侵入宿主细胞，并与宿主细侵入宿主细胞，并与宿主细胞胞DNADNA进行重组，成为宿主细胞进行重组，成为宿主细胞DNADNA的一部分，的一部分，这一过程称为这一过程称为整合整合。整合后的外来整合后的外来DNADNA仍然可随染色体仍然可随染色体DNADNA一起复制，一起复制，并在适当的条件下进行表达，但也可在相当长的并在适当的条件下进行表达，但也可在相当长的一段时间内不表达一段时间内不表达。基因工程的操作过程主要由以下步骤组成：基因工程的操作过程主要由以下步骤组成：载体和目的基因的分离载体和目的基因的分离；载体和目的基因的切断载体和目的基因的切断；载体和目的基因的重组载体和目的基因的重组；重组重组DNADNA的转化和扩增的转化和扩增；重组重组DNADNA的筛选和鉴定的筛选和鉴定。（一）载体：（一）载体：可以将目的基因运载进入细胞可以将目的基因运载进入细胞并进行复制和表达的并进行复制和表达的DNADNA分子。分子。基因工程中常用的载体基因工程中常用的载体(vector)(vector)主要包括主要包括质质粒粒(plasmid)(plasmid)、噬菌体噬菌体(phage)(phage)和和病毒病毒(virus)(virus)三大类。三大类。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。标志基因、单一的限制酶切点等。载体构建的条件：载体构建的条件：1.1.能在受体细胞中独立复制。能在受体细胞中独立复制。2.2.分子量小，易于分离、纯化、导入分子量小，易于分离、纯化、导入3.3.有限制性内切酶位点。有限制性内切酶位点。4.4.有可供选择的遗传标志。有可供选择的遗传标志。5.5.易于导入受体细胞。易于导入受体细胞。1 1质粒：质粒：是存在于天然细菌体内的一种独是存在于天然细菌体内的一种独立于细菌染色体之外的立于细菌染色体之外的双链环状双链环状DNADNA，具有，具有独独立复制立复制的能力，通常带有细菌的的能力，通常带有细菌的抗药基因抗药基因。最早使用的质粒最早使用的质粒DNADNA是人工构建的是人工构建的pBR322pBR322，该，该质粒分子大小为质粒分子大小为4.3kb4.3kb，带有抗四环素和抗氨，带有抗四环素和抗氨苄青霉素基因，含苄青霉素基因，含EcoREcoR，BamHBamH，HindHind等单一的限制酶切点。等单一的限制酶切点。质粒质粒pUC19pUC19的分子结构的分子结构2 2噬菌体：噬菌体：l可通过转染方式将其可通过转染方式将其DNADNA送入细菌体送入细菌体内进行增殖。常用的为人工构建的内进行增殖。常用的为人工构建的噬菌体载体噬菌体载体。噬菌体两端的片段对于。噬菌体两端的片段对于其包装是必需的，因而应予保留；而其包装是必需的，因而应予保留；而其中间部分则可进行改造或置换，使其中间部分则可进行改造或置换，使之具有某种单一的限制酶切点。目的之具有某种单一的限制酶切点。目的基因与噬菌体基因与噬菌体DNADNA进行重组时，可采进行重组时，可采用用插入重组方式插入重组方式，也可采用，也可采用置换重组置换重组方式方式。3 3病毒：病毒：常用的为常用的为SV40SV40，通，通过感染方式将其过感染方式将其DNADNA送入哺乳动送入哺乳动物细胞中进行增殖。目前应用物细胞中进行增殖。目前应用相对较少。相对较少。（二）目的基因：（二）目的基因：目的基因的筛目的基因的筛选和分离可采用以下方法进行：选和分离可采用以下方法进行：1 1直接从染色体直接从染色体DNADNA中分离：中分离：仅适用于原核生物基因的分离，仅适用于原核生物基因的分离，较少采用。较少采用。2 2人工合成：人工合成：根据已知多肽链的根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。适应于编码小分子多肽的基因。l l采采用用一一定定的的方方法法钓钓取取特特定定基基因因的的mRNAmRNA，再再通通过过逆逆转转录录酶酶催催化化合合成成其其互互补补DNADNA（cDNAcDNA），除除去去RNARNA链链后后，再再用用DNADNA聚聚合合酶酶合合成成其其互互补补DNADNA链链，从从而而得得到到双双链链DNADNA。这这一一方方法法通通常常可可得得到到可可表表达达的的完完整整基基因因。3 3从从mRNAmRNA合成合成cDNAcDNA：4 4从基因文库中筛选：从基因文库中筛选：将某一种基因将某一种基因DNADNA用适用适当的限制酶切断后，与载体当的限制酶切断后，与载体DNADNA重组，再全部转重组，再全部转化宿主细胞，得到含全部基因组化宿主细胞，得到含全部基因组DNADNA的种群，称的种群，称为为G G文库文库(genomic DNA library)(genomic DNA library)。将某种细胞的全部将某种细胞的全部mRNAmRNA通过逆转合成通过逆转合成cDNAcDNA，然，然后转化宿主细胞，得到含全部表达基因的种群，后转化宿主细胞，得到含全部表达基因的种群，称为称为C-C-文库文库(cDNA library)(cDNA library)。C-C-文库具有组织文库具有组织细胞特异性。细胞特异性。THANK YOUSUCCESS2024/5/8 周三15可编辑基因组文库的制作基因组文库的制作5 5利用利用PCRPCR合成：合成：l l如已知目的基因两如已知目的基因两端的序列，则可采端的序列，则可采用聚合酶链反应用聚合酶链反应（polymerase polymerase chain chain reaction,PCRreaction,PCR）技）技术，在体外合成目术，在体外合成目的基因。但此法可的基因。但此法可能会造成克隆的目能会造成克隆的目的基因碱基序列的的基因碱基序列的改变。改变。二、载体和目的基因的切断：二、载体和目的基因的切断：通常采用通常采用限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)(restriction endonuclease)，简称限制酶，简称限制酶，分别对载体分别对载体DNADNA和目的基因进行切断，以便和目的基因进行切断，以便于重组。限制酶目前已经发现于重组。限制酶目前已经发现400400多种，所多种，所识别的顺序往往为识别的顺序往往为4-84-8个碱基对，且有个碱基对，且有回文回文结构结构。由限制酶切断后的末端可形成由限制酶切断后的末端可形成平端、平端、3-3-突出粘性末端和突出粘性末端和5-5-突出粘性末端突出粘性末端三种情三种情况。形成粘性末端况。形成粘性末端(cohesive end)(cohesive end)者较有利者较有利于载体于载体DNADNA和目的基因的重组。和目的基因的重组。三、载体和目的基因的重组（接）三、载体和目的基因的重组（接）即将带即将带有切口的载体与所获得的目的基因连接起有切口的载体与所获得的目的基因连接起来，得到重新组合后的来，得到重新组合后的DNADNA分子。分子。（一）粘性末端连接法：（一）粘性末端连接法：当载体当载体DNADNA和目的和目的基因均用同一种限制酶进行切断时，二者基因均用同一种限制酶进行切断时，二者即可带有相同的粘性末端。如将载体与目即可带有相同的粘性末端。如将载体与目的基因混合在一起，二者即可通过粘性末的基因混合在一起，二者即可通过粘性末端进行互补粘合，再加入端进行互补粘合，再加入DNADNA连接酶，即可连接酶，即可封闭其缺口，得到重组体。封闭其缺口，得到重组体。较少的情况下，较少的情况下，对产生的平端也可直接进行连接。对产生的平端也可直接进行连接。载体载体DNADNA与目的基因的连接与目的基因的连接（二）人工接尾法：（二）人工接尾法：即同聚物加尾连接法。即同聚物加尾连接法。当载体和目的基因无法采用同一种限制酶当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断，无法得到相同得粘性末端时，进行切断，无法得到相同得粘性末端时，可采用此方法。可采用此方法。此法首先使用单链核酸酶此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端核苷酸转移酶将粘性末端切平，再在末端核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于载体的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的基因的或目的基因的3-3-端，如载体上添加一段端，如载体上添加一段polyGpolyG，则可在目的基因上添加一段，则可在目的基因上添加一段polyCpolyC，故二者即可通过碱基互补进行粘合，再，故二者即可通过碱基互补进行粘合，再由由DNADNA连接酶连接。连接酶连接。四、重组四、重组DNADNA的转化和扩增（转）的转化和扩增（转）重组重组DNADNA需需导入宿主细胞才能进行增殖或表达。重组质导入宿主细胞才能进行增殖或表达。重组质粒可通过粒可通过转化转化（transformationtransformation）方式导入）方式导入宿主细胞，即将大肠杆菌用宿主细胞，即将大肠杆菌用CaClCaCl2 2处理，增加处理，增加细菌细胞壁的通透性，再与重组质粒细菌细胞壁的通透性，再与重组质粒DNADNA短暂短暂温育，质粒温育，质粒DNADNA即可导入宿主细胞。即可导入宿主细胞。如果是用如果是用噬菌体作为载体的重组体，则需噬菌体作为载体的重组体，则需要用外壳蛋白进行包装，使之成为具有感染要用外壳蛋白进行包装，使之成为具有感染能力的噬菌体，再通过能力的噬菌体，再通过转染转染(transfection)(transfection)方式将重组噬菌体方式将重组噬菌体DNADNA导入大肠杆菌等宿主导入大肠杆菌等宿主细胞。细胞。重组重组DNADNA导入宿主细胞后，即可在适导入宿主细胞后，即可在适当的培养条件下进行培养以扩增宿主细胞。当的培养条件下进行培养以扩增宿主细胞。对于质粒对于质粒DNADNA，还可通过在培养基中加入氯，还可通过在培养基中加入氯霉素，抑制细菌蛋白质合成及染色体霉素，抑制细菌蛋白质合成及染色体DNADNA的的复制，以单独扩增细胞中的质粒复制，以单独扩增细胞中的质粒DNADNA。五、重组五、重组DNADNA的筛选和鉴定（筛）的筛选和鉴定（筛）由于重组由于重组体导入宿主细胞的比例通常较低，因此需要体导入宿主细胞的比例通常较低，因此需要对含有重组体的宿主细胞进行筛选并作鉴定。对含有重组体的宿主细胞进行筛选并作鉴定。可采用以下方法进行：可采用以下方法进行：（一）根据重组体的表型进行筛选（一）根据重组体的表型进行筛选：对于对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用带有抗药基因的质粒重组体，可采用插入灭插入灭活法活法进行筛选。如进行筛选。如pBR322pBR322中带有抗氨苄青霉中带有抗氨苄青霉素和抗四环素基因，当将目的基因插入抗四素和抗四环素基因，当将目的基因插入抗四环素基因后，就可引起该基因失活，细菌对环素基因后，就可引起该基因失活，细菌对氨苄青霉素耐药，而对四环素敏感。在含氨氨苄青霉素耐药，而对四环素敏感。在含氨苄青霉素的培养基上能够生长，而在含四环苄青霉素的培养基上能够生长，而在含四环素的培养基上不能生长的细菌即为带重组体素的培养基上不能生长的细菌即为带重组体的细菌。的细菌。插插入入灭灭活活法法筛筛选选重重组组体体（二）根据标志互补进行筛选：（二）根据标志互补进行筛选：当宿主细当宿主细胞存在某种基因及其表达产物的缺陷时，可胞存在某种基因及其表达产物的缺陷时，可采用此方法筛选重组体。即在载体采用此方法筛选重组体。即在载体DNADNA分子分子中插入相应的缺陷基因，如宿主细胞重新获中插入相应的缺陷基因，如宿主细胞重新获得缺陷基因的表达产物，则说明该细胞中带得缺陷基因的表达产物，则说明该细胞中带有重组体。有重组体。（三）根据（三）根据DNADNA限制酶谱进行分析：限制酶谱进行分析：经过经过粗筛后的含重组体的细菌，还需进行限制酶粗筛后的含重组体的细菌，还需进行限制酶谱分析进一步鉴定。将单一细菌进行扩增后谱分析进一步鉴定。将单一细菌进行扩增后分别提取其分别提取其DNADNA，用重组时所用的同一限制，用重组时所用的同一限制酶进行酶切，再将其与不含目的基因的载体酶进行酶切，再将其与不含目的基因的载体一起进行电泳比较分析，如发现出现目的基一起进行电泳比较分析，如发现出现目的基因片段的电泳带即证明重组体中带有目的基因片段的电泳带即证明重组体中带有目的基因。因。（四）用核酸杂交法进行分析鉴定：（四）用核酸杂交法进行分析鉴定：l l为了进一步鉴定为了进一步鉴定重组基因体中的目的基因，可采用与目的基因部分互补重组基因体中的目的基因，可采用与目的基因部分互补的的DNADNA片段作为探针，与含有重组体的细菌菌落进行杂交，片段作为探针，与含有重组体的细菌菌落进行杂交，经放射自显影，如结果为阳性，即可确定重组体中带目经放射自显影，如结果为阳性，即可确定重组体中带目的基因。的基因。THANK YOUSUCCESS2024/5/8 周三29可编辑