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分子生物学实验-质粒的提取和酶切鉴定.ppt
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1、The extraction andendonuclease cleavage of plasmid质粒的提取和酶切鉴定huang chunhong掌握质粒掌握质粒DNA提取的原理与方法提取的原理与方法 了解了解DNA限制性核酸内切酶酶切限制性核酸内切酶酶切鉴定原理鉴定原理 质粒为环状双链质粒为环状双链DNA,它是染色体,它是染色体DNA之外之外的单独复制单元。质粒一般存在于细菌细胞中,并的单独复制单元。质粒一般存在于细菌细胞中,并常用于常用于DNA重组,用于外源基因的克隆和表达。重组,用于外源基因的克隆和表达。质粒的分类与构成质粒的分类与构成克隆载体;表达载体克隆载体;表达载体原核质粒;真核
2、质粒原核质粒;真核质粒质粒的构成质粒的构成 -复制起始位点复制起始位点 -多克隆位点(含多个内切酶位点,用于外源基因插入)多克隆位点(含多个内切酶位点,用于外源基因插入)-选择性标记(抗性基因)选择性标记(抗性基因)1.氨苄青霉素抗性,氨苄青霉素抗性,新霉素抗性。新霉素抗性。2.多克隆位点多克隆位点C端含有端含有myc表位表位标签和标签和His6标签。标签。Myc标签和标签和His6标签与外源蛋白融合表达,标签与外源蛋白融合表达,可以用以亲和层析分离和可以用以亲和层析分离和western blot3.Pcmv 巨细胞疱疹病毒启动子巨细胞疱疹病毒启动子4.BGHpA,牛生长因子牛生长因子poly
3、A5.SV40 猴空泡病毒猴空泡病毒 SV40pA 猴空泡病毒猴空泡病毒polyA7.核糖体结合核糖体结合位点:位点:5300-5304bp6.pUC ori复制起始位点复制起始位点 f1 ori 噬菌体复制位点,能产噬菌体复制位点,能产生单链生单链DNA,可用于测序,可用于测序 T7启动子,比大启动子,比大肠杆菌肠杆菌RNA聚合聚合酶启动子强酶启动子强5倍倍pCDNA3.1/myc-His-IFT57重组质粒:6475bppCDNA3.1/myc-His:5497bp(讲义上错误)IFT57基因(intraflagellar transport 57,鞭毛内运输蛋白):1270bp酶切位点:
4、BamHI:GGATCC 920bp EcoRI:GAATTC 941bp质粒提取:碱裂解法 基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。染色体DNA:氢键断裂变性。质粒DNA:大部分氢键断裂,但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。(不完全变性)质粒质粒DNA:复性复性,溶于溶液中,溶于溶液中染色体染色体DNA:不能复性不能复性;形成缠连;形成缠连的网状结构。的网状结构。pH=12.6(碱性)NaAc溶液(pH4.8)pH=中性染色体染色体DNA与不稳定的大分子与不稳定的大分子RNA、蛋白质蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来复合物等一起沉淀下来离心溶菌酶可破坏菌体细胞
5、壁,十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate,SDS)可使细胞壁裂解。细菌经溶菌酶和阴离子去污剂(SDS)处理后,细菌DNA缠绕附着在细胞壁碎片上,离心时易被沉淀出来,而质粒DNA则留在上清液中。再经酒精沉淀、洗涤处理,可得到质粒DNA。提取的质粒可有三种结构:线形、开环、闭环超螺旋。溶液溶液溶菌液:50mM 葡萄糖,25mM Tris-Cl(pH8.0),10mM EDTA,2mg/ml 溶菌酶溶菌酶。溶液溶液 NaOH-SDS液:0.2N NaOH,1%SDS。溶液溶液 3mol/L NaAc(pH4.8)溶液:5M KAC 10ml,冰醋酸 11.5ml,水 28.5
6、ml。质粒抽提:即去除RNA,将质粒与细菌基因组DNA分开,去除蛋白质及其它杂质,以得到相对纯净的质粒。如何去除 RNA使用 RNase 消化(抽提中或者抽提后)。经过 RNase 消化后,RNA 变得比较小了,其残留对酶切反应几乎没有影响。The principles of plasmid extraction如何将质粒与细菌基因组DNA分开利用 NaOH/SDS 完全裂解细菌,让质粒和细菌基因组 DNA 都从细菌中出来,再利用质粒和基因组 DNA 在变性/复性过程中的不同表现,将质粒与基因组 DNA 分开。去除蛋白质及其它杂质基本上是与去除细菌基因组同时实现的。但是,依据不同的细菌,不同的
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