多重连接探针扩增MLPA的原理及其应用.pptx
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1、MLPAMLPA技术简介技术简介主要内容主要内容MLPAMLPA技术特点与主要应用领域技术特点与主要应用领域MLPAMLPA技术工作流程技术工作流程数据分析数据分析(Coffalyser(Coffalyser的使用的使用)MLPA技术简介MLPA:多重连接探针扩增技术 主要应用领域:多重检测人类基因组序列中微小的拷贝数变异该技术于2002年首次发表:Schouten JP et al:Nucleic Acids Res.30:e57。发表的MLPA技术相关的文章超过一千篇。每年运行的MLPA测试超过一百万次。使用MLPA技术的实验室超过一千个并分布于在80个不同的国家。荷兰MRC公司提供MLP
2、A试剂盒包括了300多种的应用领域:-人类基因组学 -分子细胞遗传学 -肿瘤诊断学多重连接探针扩增技术原理1.变性变性&2 杂交杂交PCR 上游引物杂交序列PCR 下游引物上下游杂交探针彼此相邻,由热稳定的连接酶连接。3.连接连接目标序列 BX553YX 553目标序列 AY53目标序列 A目标序列 B53间隔序列(对于不同探针长短不同)4.PCR每种探针的扩增产物都有自己特异的标志性长度(130-480 bp)。5353XY53XY53所有连接产物均由同一对引物进行PCR扩增。5.毛细管电泳分析扩增产物毛细管电泳分析扩增产物 通过与对照DNA标本比较相同片段长度峰高的不同来确定目标序列的对拷
3、贝数变化。Schouten,J.P.et al.Nucl.Acid Res.30,e57.555EcoRVSphIXbaIBsmI“Stuffer”sequencePCR primer sequence(vector:blue plaques)EcoRVSphIXbaIBsmI“Stuffer”sequencePCR primer sequence(clone:white plaques)EcoRVBsmI 人工合成的杂交序列被克隆到来源于人工合成的杂交序列被克隆到来源于M13的的SALSA载体上。载体上。每个每个SALSA 载体都包括了一段不同长度的载体都包括了一段不同长度的间隔序列。间隔序
4、列。通过克隆获得单链通过克隆获得单链 DNA。将两个短的寡核苷酸序列与单链将两个短的寡核苷酸序列与单链DNA退火,退火,从而获得带从而获得带BsmI and EcoRV位点的双链位点的双链DNA。Hybridising sequence 经经EcoRV and BsmI酶切后酶切后,可以获得可以获得85-440 nt长的探针序列长的探针序列.“Stuffer”sequenceHybridising sequencePCR primer sequence右侧杂交探针的制备MLPA 工作原理特点1、检测对象为和两条MLPA探针完全配对的样品DNA序列;2、扩增对象是杂交在样品上的两条探针由连接酶进
5、行连接之后的产物;3、不同基因的连接产物长度不同;4、多重的连接产物能够被同一对引物扩增;PCR具有高度的同步性;5、扩增产物(大小一般为130-500nt)用于毛细管电泳分析;6、基因拷贝数变化直接体现在毛细管电泳结果的峰面积差异;7、基因点突变体现在扩增峰缺失;8、所需仪器只需普通PCR仪和一台测序用的毛细管电泳仪。耗时在24小时以内。MLPA 工作流程MLPA 的操作流程1.变性样品DNA在98度下加热5分钟。2.杂交往变性后的样品中加入 SALSA 探针混合液和MLPA 缓冲液。混合体系在95度下加热1分钟后在60度下温浴杂交16个小时。3.连接在杂交产物中加入连接酶混合液在54度下温
6、浴连接15分钟。98度加热5分钟使连接酶失活。4.PCR加入引物,dNTP和DNA聚合酶。PCR反应。5.毛细管电泳将扩增片段长度和结果峰导入到excel表中。分析结果。P002;5 ng.DNA10 ng.DNA20 ng.DNA50 ng.DNAX=引物二聚体X=引物二聚体MLPA 质控片段可以识别 DNA样品浓度是否合适每个MLPA 探针混合液都包括质控片段1.当DNA样品量不足时,4个质控片段(64-70-76-82 nt)的峰会产生很高的信号2.当DNA样品变性不完全时,两个探针(88-96 nt)会给出警示信号.3.X 染色体(100 nt)和 Y 染色体(105 nt)片段可以指
7、示样本是否置换.4x Q-fragmentsXY2x DNA Denaturation control fragmentsTE,98 oC.TE,94 oC.TE,98 oC.TE,82 oC.TE,98 oC.TE,76 oC,并不是所有的染色体区域都变性DNA样本的要求MLPA反应要求基因组DNA的使用量范围为20-500 ng。为了减少差异,尽量使用与待测样本来源相同和提取方法一致的样本作参照。长时间的存储和反复冻融可能会影响样本的质量和MLPA的检测结果。一些污染物可能会影响MLPA的结果(如影响模板变性或PCR扩增)。DNA 变性变性Tm 依赖于 GC含量.Tm 受盐离子浓度影响,当
8、盐浓度提高10倍时,Tm可以提高10倍.DMSO/甲酰胺可以降低Tm.其它的化合物?TE,98 oC.TE+50 mM KCl;98 oC.TE,98 oC.TE+50 mM KCl;94 oC.The presence of 50 mM salt results in a much higher melting temperature.Some sequences in strong CpG islands are not denatured at 94 oC.TE,98 oC.TE+1.6 mM MgCl2,98 oC.即使是在 98 C,一些 CpG 岛区域 并不能完全变性(TE+低浓度
9、MgCl2)98 oC 加热80分钟98 oC 加热20分钟98 oC 加热5分钟由于MLPA探针识别序列仅约70nt,因此可用于DNA碎片的检测,即使长时间的对DNA样品加热导致其断裂也不会对最终检测结果造成大影响。可检测降解DNAMLPA工作流程1.变性样品DNA在98度下加热5分钟。2.杂交往变性后的样品中加入 SALSA 探针混合液和MLPA 缓冲液。混合体系在95度下加热1分钟后,在60度下温浴杂交16个小时。3.连接在杂交产物中加入连接酶混合液在54度下温浴连接15分钟。98度加热5分钟使连接酶失活。4.PCR加入引物,dNTP和DNA聚合酶。PCR反应。5.毛细管电泳将扩增片段长
10、度和结果峰导入到excel表中。分析结果。杂交杂交溶液体积溶液体积:8 L 杂交时间杂交时间 60 C杂交16小时,即使是延长到20小时也可以。溶液的盐浓度溶液的盐浓度:盐浓度在杂交反应中为 350 mM。杂交温度杂交温度:杂交 温度 62 C会导致杂交探针不稳定;杂交温度 90%在两分钟之内完成,连接反应在 5 min到25 min都可以。DNA连接酶的量非常重要过量的DNA连接酶易造成非特异连接连接反应中盐浓度降低到75 mM.,由于探针Tm在低盐时会降低,故连接反应温度降低到54 oC。连接酶为NAD(Ligation buffer A)和镁离子(ligation buffer B)依赖
11、的,因此,buffers A and B不能反复冻融。MLPA工作流程1.变性样品DNA在98度下加热5分钟。2.杂交往变性后的样品中加入 SALSA 探针混合液和MLPA 缓冲液。混合体系在95度下加热1分钟后在60度下温浴杂交16个小时。3.连接在杂交产物中加入连接酶混合液在54度下温浴连接15分钟。98度加热5分钟使连接酶失活。4.PCR加入引物,dNTP和DNA聚合酶。PCR反应。5.毛细管电泳将扩增片段长度和结果峰导入到excel表中。分析结果。PCR反应引物混合液包含了一条荧光标记引物和一条未标记引物和 dNTPs.对于不同的型号的毛细管电泳仪,可能需使用不同荧光标记的通用引物,其
12、中ABI系列的毛细管的电泳仪需使用FAM标记的通用引物,Beckman系列的需使用Cy5.0标记的通用引物。SALSA DNA聚合酶与Taq DNA聚合酶类似,但浓度更高.有些探针对DNA酶活性较为敏感,由于 DNA纯度可以影响DNA聚合酶活性,故DNA不纯可以导致部分探针信号较低。要求质控DNA与样本DNA提取方法一致.PCR循环数影响不是很大.PCR终止是由于引物的消耗完.MLPA工作流程1.变性样品DNA在98度下加热5分钟。2.杂交往变性后的样品中加入 SALSA 探针混合液和MLPA 缓冲液。混合体系在95度下加热1分钟后在60度下温浴杂交16个小时。3.连接在杂交产物中加入连接酶混
13、合液在54度下温浴连接15分钟。98度加热5分钟使连接酶失活。4.PCR加入引物,dNTP和DNA聚合酶。PCR反应。5.毛细管电泳将扩增片段长度和结果峰导入到excel表中。分析结果。毛细管电泳需要将片段大小和峰面积导到Excel中分析结果Coffalyser().MLPA技术特点与主要应用领域MLPA 技术特点单管PCR反应检测50种DNA序列的拷贝数差异。MLPA应用的拓展:-mRNA的相对定量 -检测启动子区域的甲基化异常 -检测已知突变如BRAF V600E只需20ng人类基因组DNA的模板量(相当于3000个细胞)。可以区别目标序列中的单碱基突变。MLPA技术可以检测已经部分降解的
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- 多重 连接 探针 扩增 MLPA 原理 及其 应用
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