核酸的提取.ppt
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1、第一部分:第一部分:DNADNA提取方法简介提取方法简介第二部分:第二部分:DNADNA提取常见问题、提取常见问题、原因分析及其对策原因分析及其对策教学内容教学内容第三部分:第三部分:RNARNA提取方法简介提取方法简介第四部分:第四部分:RNARNA提取及其提取及其RT-PCRRT-PCR常见常见 问题、原因分析及其对策问题、原因分析及其对策第二部分:第二部分:DNADNA提取常见问题、提取常见问题、原因分析及其对策原因分析及其对策 核酸是核酸是18691869年米歇尔年米歇尔(F.Miescher)(F.Miescher)在脓液在脓液 白细胞中发现的,他白细胞中发现的,他当时称之为核素。阿
2、当时称之为核素。阿尔特曼尔特曼(R.Altmann)(R.Altmann)于于18891889年认识其酸性年认识其酸性后,定名为核后,定名为核 酸。酸。核酸分为核糖核酸核酸分为核糖核酸 (RNA)(RNA)和脱氧核糖核和脱氧核糖核酸酸(DNA)(DNA)两大类。两大类。核酸的发现核酸的发现核核 酸酸(nucleic acid)是以核苷酸为基本组成单位的生物大是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子,携带和传递遗传信息。分子,携带和传递遗传信息。是遗传信息的载体,是最重要的生物是遗传信息的载体,是最重要的生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象,信息分子,是分子生物学研究的主要对象,因此核酸的提取是
3、分子生物学实验技术中因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作最重要、最基本的操作 。核酸的分类及分布核酸的分类及分布 90%90%以以上上分分布布于于细细胞胞核核,其其余余分分布布于于核外核外如线粒体,叶绿体,质粒等。如线粒体,叶绿体,质粒等。分布于胞核、胞液。分布于胞核、胞液。(deoxyribonucleic acid,DNA)(ribonucleic acid,RNA)脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸 核糖核酸核糖核酸携带遗传信息,决定细胞和个携带遗传信息,决定细胞和个体的基因型体的基因型(genotype)(genotype)。参与细胞内参与细胞内DNADNA遗传信息的表达。遗
4、传信息的表达。某些病毒某些病毒RNARNA也可作为遗传信息也可作为遗传信息的载体。的载体。核酸的理化性质核酸的理化性质l晶形 DNADNA为白色纤维状固体为白色纤维状固体 RNARNA为白色粉末状固体为白色粉末状固体l两性解离 呈酸性呈酸性 在中性溶液中带负电荷在中性溶液中带负电荷l溶解性 均溶于水均溶于水 不溶于一般有机溶剂不溶于一般有机溶剂,在在70%70%乙醇中形成沉淀乙醇中形成沉淀 0.14MNaCl 12MNaCl0.14MNaCl 12MNaCl DNA-DNA-蛋白蛋白 溶解度溶解度低低 溶解度溶解度高高 RNA-RNA-蛋白蛋白 溶解度溶解度高高 溶解度溶解度低低l粘度粘度 D
5、NADNA粘度粘度大大(因其分子直径小而长度大因其分子直径小而长度大)RNARNA粘度粘度小小 核酸变性或降解后粘度降低核酸变性或降解后粘度降低l旋光性旋光性 均很强均很强l密度密度 RNARNA双链双链DNADNA;环状环状DNA DNA 开环、线状开环、线状DNADNA 单链单链DNA DNA 双链双链DNA DNA l沉降速度:沉降速度:RNA RNA 环状环状DNA DNA 开环、线状开环、线状DNADNA核酸分离、纯化原则核酸分离、纯化原则意义:遗传信息全部储存意义:遗传信息全部储存在一级结构之中,核酸的在一级结构之中,核酸的级结构还决定其高级结级结构还决定其高级结构的形式以及和其他
6、生物构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。大分子结合的方式。分离核酸原则:分离核酸原则:温度不要太高温度不要太高控制控制pHpH值范围值范围(pH(pH值值5-9)5-9)保持一定离子强度保持一定离子强度减少物理因素对核酸的机减少物理因素对核酸的机械剪切力械剪切力.保持核酸分子一级结构保持核酸分子一级结构的完整性的完整性防止核酸的生物降解防止核酸的生物降解防止核酸的生物降解防止核酸的生物降解细胞内或外来的各种核酸细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键,破坏核酸一级结二酯键,破坏核酸一级结构构。所用器械和一些试剂需高所用器械和一些试剂需高温灭菌温灭菌提取缓冲液
7、中需加核酸酶提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂抑制剂金属离子螯合剂:金属离子螯合剂:DNADNA酶需要金属二价离酶需要金属二价离子子Mg2+Mg2+、Ca2+Ca2+的激活,的激活,因此使用金属二价离因此使用金属二价离子螯合剂,可抑制子螯合剂,可抑制DNADNA酶活性。如酶活性。如EDTA-EDTA-Na2(Na2(乙二胺四乙酸二乙二胺四乙酸二钠钠)、8-8-羟基喹啉;羟基喹啉;阴离于型表面活性剂阴离于型表面活性剂 如如SDSSDS,该试剂除对核,该试剂除对核酸酶有抑制作用外,酸酶有抑制作用外,还能使蛋白质变性,还能使蛋白质变性,并与变性蛋白结合成并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物,带负电荷的复合物
8、,该复合物在高盐溶液该复合物在高盐溶液中沉淀提取缓冲液中中沉淀提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂需加核酸酶抑制剂DNADNA酶抑制剂酶抑制剂RNARNA酶(酶(RNAase)RNAase)抑制剂抑制剂皂土(皂土(bentonitebentonite):皂土带负电荷,能吸附皂土带负电荷,能吸附RNaseRNase,使其失活。,使其失活。DEPC(DEPC(二乙基焦碳酸盐二乙基焦碳酸盐)(C2H5OCOOCOOC2H5)(C2H5OCOOCOOC2H5)粘性液体,很强的核酸酶抑制剂。与蛋白质中粘性液体,很强的核酸酶抑制剂。与蛋白质中HisHis结结 合使蛋白变性。合使蛋白变性。使用注意使用注意:1.DE
9、PC1.DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白质变性的浓度大但浓度比使蛋白质变性的浓度大10010010001000倍。倍。2.2.容易降解,保存在容易降解,保存在4 4 或液氮中;或液氮中;3.3.提提RNARNA时,时,0.1%DEPC0.1%DEPC浸泡器皿浸泡器皿37 2 h37 2 h。4.4.剧毒。剧毒。肝素肝素复合硅酸盐(复合硅酸盐(Macaloid)Macaloid)RNaseRNase阻抑蛋白(阻抑蛋白(RNasinRNasin)氧钒核糖核苷复合物氧钒核糖核苷复合物 (Vanadyl-(Vanadyl-Ribonucleos
10、ide Complex,VRC)Ribonucleoside Complex,VRC)DNADNA提取的基本步骤提取的基本步骤I.I.材料准备材料准备II.II.破碎细胞或包膜内容物释放破碎细胞或包膜内容物释放III.III.核酸分离、纯化核酸分离、纯化IV.IV.沉淀或吸附核酸,并去除杂质沉淀或吸附核酸,并去除杂质V.V.核酸溶解在适量缓冲液或水中核酸溶解在适量缓冲液或水中材料准备材料准备最好使用新鲜材料,最好使用新鲜材料,低温保低温保存的样品材料不要反复冻融存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组提取血液基因组DNADNA时,要选时,要选择有核细胞(白细胞)择有核细胞(白细胞)组培细胞培养时
11、间不能过长,组培细胞培养时间不能过长,否则会造成否则会造成DNADNA降解降解含病毒的液体材料含病毒的液体材料DNADNA含量较含量较少,提取前先富集少,提取前先富集基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取使用处于对数期的新鲜菌体(老使用处于对数期的新鲜菌体(老化菌体导致开环质粒增加)化菌体导致开环质粒增加)培养时应加入筛选压力,否则菌培养时应加入筛选压力,否则菌体易污染,质粒易丢失体易污染,质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒,如为低尽量选择高拷贝的质粒,如为低拷贝或大质粒,则应加大菌体拷贝或大质粒,则应加大菌体用量用量菌株不要频繁转接(质粒丢失)菌株不要频繁转接(质粒
12、丢失)细胞裂解细胞裂解经典的裂解液几乎都含有经典的裂解液几乎都含有去污剂和盐去污剂和盐盐的作用盐的作用提供一个合适的裂解环境提供一个合适的裂解环境 抑制样品中的核酸酶抑制样品中的核酸酶去污剂去污剂 使蛋白质变性使蛋白质变性蛋白酶蛋白酶裂解液裂解液裂解方法裂解方法机械法机械法化学试剂法化学试剂法反复冻融法反复冻融法酶解法酶解法确保彻底裂解样品确保彻底裂解样品使裂解体系中核酸浓度适中使裂解体系中核酸浓度适中以样品中蛋白质的含量为基准以样品中蛋白质的含量为基准裂解液的用量原则裂解液的用量原则含蛋白酶的裂解方法:基因组含蛋白酶的裂解方法:基因组DNADNA高浓度蛋白变性剂的裂解方法:高浓度蛋白变性剂的
13、裂解方法:RNARNA含含CTABCTAB的裂解法:的裂解法:富含多糖的样品的基因组 DNA含SDS碱裂解法:质粒DNA裂解方法评价裂解方法评价细胞裂解细胞裂解材料应适量,过多会影响裂解,材料应适量,过多会影响裂解,导致导致DNADNA量少,纯度低量少,纯度低针对不同材料,选择适当的裂针对不同材料,选择适当的裂解预处理方式:解预处理方式:植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨组培细胞蛋白酶组培细胞蛋白酶K K细菌溶菌酶破壁细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠酵母破壁酶或玻璃珠高温温浴时,定时轻柔振荡高温温浴时,定时轻柔振荡螯合剂螯合剂基因组基因组DNADNA的
14、提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取菌体量适当菌体量适当培养基去除干净,同时保证菌体培养基去除干净,同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮在悬浮液中充分悬浮变性的时间不要过长(变性的时间不要过长(5 5分钟),分钟),否则质粒易被打断否则质粒易被打断复性时间也不宜过长,否则会有复性时间也不宜过长,否则会有基因组基因组DNADNA的污染的污染G G菌、酵母质粒的提取,应先菌、酵母质粒的提取,应先用酶法或机械法处理,以破壁用酶法或机械法处理,以破壁核酸分离、纯化核酸分离、纯化q蛋白质的去除:蛋白质的去除:酚酚/氯仿抽提氯仿抽提使用变性剂变性(使用变性剂变性(SDSSDS、异硫氰酸胍等)、异硫氰酸胍等
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