环介导等温扩增技术.ppt
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1、环介导等温扩增(环介导等温扩增(LAMPLAMP)检测金黄色葡萄球菌)检测金黄色葡萄球菌摘要摘要:建立一种能够快速准确地检测金黄色葡萄球菌的建立一种能够快速准确地检测金黄色葡萄球菌的LAMPLAMP方法。根据金黄色葡萄球菌的方法。根据金黄色葡萄球菌的femAfemA基因设计了引物基因设计了引物,然后进行然后进行LAMPLAMP反应条件的优化、特异性和灵敏度的检测反应条件的优化、特异性和灵敏度的检测并与实际样品进行检出率的比较。并与实际样品进行检出率的比较。LAMPLAMP方法特异性好方法特异性好,最最佳反应温度为佳反应温度为61,61,只对金黄色葡萄球菌进行扩增只对金黄色葡萄球菌进行扩增;灵敏
2、灵敏度高度高,金黄色葡萄球菌的检测灵敏度为金黄色葡萄球菌的检测灵敏度为8 89cfu/mL9cfu/mL时仍时仍能检出。能检出。LAMPLAMP方法检测金黄色葡萄球菌特异性强、灵敏方法检测金黄色葡萄球菌特异性强、灵敏度高、时间短且操作简便度高、时间短且操作简便,有望成为快速检测金黄色葡萄有望成为快速检测金黄色葡萄球菌的新方法。球菌的新方法。简介:金黄色葡萄球菌简介:金黄色葡萄球菌(S taphy lococcus aureus)(S taphy lococcus aureus)是引起食是引起食物中毒的主要致病菌之一物中毒的主要致病菌之一,也是引起奶牛患乳房炎的重要病也是引起奶牛患乳房炎的重要病
3、原菌原菌,在自然界中广泛存在在自然界中广泛存在,食品受污染的机会很多。近年食品受污染的机会很多。近年来随着抗生素的大量使用来随着抗生素的大量使用,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin(methicillinresistantStaphylococcus aureus,MRSA)resistantStaphylococcus aureus,MRSA)大量出现。金黄色葡萄球菌产生的肠毒素是引起食物中毒大量出现。金黄色葡萄球菌产生的肠毒素是引起食物中毒的主要原因的主要原因,每年都有肠毒素中毒的报道每年都有肠毒素中毒的报道,已经成为世界性已经成为世界性的卫生问题。因
4、此建立快速、简便地检测金黄色葡萄球菌的卫生问题。因此建立快速、简便地检测金黄色葡萄球菌的方法一直是研究的热点。目前的方法一直是研究的热点。目前,金黄色葡萄球菌的检测方金黄色葡萄球菌的检测方法有很多法有很多,主要有分离培养法、琼脂扩散法、免疫学方法、主要有分离培养法、琼脂扩散法、免疫学方法、基因芯片法、基因探针法、测试片法、基因芯片法、基因探针法、测试片法、PCR PCR 法等。法等。环介导恒温扩增技术环介导恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amp(loop-mediated isothermal amp lification,LAMP)lification,LAM
5、P)是是NotomiNotomi等等20002000年发明的一种新颖的扩增技术年发明的一种新颖的扩增技术,其特点是针对靶基因的其特点是针对靶基因的6 6个区域设计个区域设计4 4种特异引物种特异引物,在在DNADNA聚合酶聚合酶(B st(B st DNA polymerase)DNA polymerase)的作用下的作用下,恒温条件下进行核酸扩增恒温条件下进行核酸扩增,具有操作简单、具有操作简单、特异性强特点。另外通过环引物的添加特异性强特点。另外通过环引物的添加,大大加快了反应的速度大大加快了反应的速度 。国外报道国外报道,LAMP,LAMP被广泛食品等病原菌的检测中被广泛食品等病原菌的检
6、测中,如巴西芽生菌、锥虫如巴西芽生菌、锥虫病病 、沙门氏菌、沙门氏菌 、虾中的白斑综合症病毒、虾中的白斑综合症病毒 、志贺氏菌属和大肠杆菌、志贺氏菌属和大肠杆菌 。本研究针对金黄色葡萄球菌的。本研究针对金黄色葡萄球菌的femAfemA基因设计一套基因设计一套LAMPLAMP引物引物,对金黄对金黄色葡萄球菌进行检测色葡萄球菌进行检测,优化反应条件优化反应条件,确定检测特异性确定检测特异性,对对lamplamp法与法与PCRPCR法的灵敏度进行了对比。法的灵敏度进行了对比。LAMPLAMP的技术原理:的技术原理:LAMP LAMP方法的特点是针对靶基因的方法的特点是针对靶基因的6 6个区域设计个区
7、域设计4 4 种特异引物种特异引物,利用一种链置换利用一种链置换DNA DNA 聚合酶聚合酶(BstDNApolymerase)(BstDNApolymerase)在恒温条件在恒温条件(60(60 65)65)保温几十保温几十分钟分钟,即可完成核酸扩增反应即可完成核酸扩增反应,直接靠扩增副产物焦磷酸镁直接靠扩增副产物焦磷酸镁沉淀的浊度进行判断是否发生反应。短时间扩增效率可达沉淀的浊度进行判断是否发生反应。短时间扩增效率可达到到101099 10101010个拷贝。个拷贝。不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程。电泳、紫外观察等过
8、程。材料与方法材料与方法1.1.材料与仪器材料与仪器 材料:材料:金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(Staphylococcusaureus)、大肠杆菌、大肠杆菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)、铜绿假单胞、铜绿假单胞菌菌(Pseudom onas aeruginosa)(Pseudom onas aeruginosa)、沙门氏菌、沙门氏菌(Salm onella enterica)Salm onella enterica)、沙门氏菌、沙门氏菌(Salm(Salm onella sp)onella sp)、荧光假单
9、胞菌、荧光假单胞菌(Pseudom onas f(Pseudom onas f luorescence)luorescence)、恶臭假单胞菌、恶臭假单胞菌(Pseudom onas(Pseudom onas putida)putida),沙门氏菌,沙门氏菌(Salm onellaHJ-004)(Salm onellaHJ-004)、志贺菌志贺菌(Shigella spp )(Shigella spp )、单增李斯特菌、单增李斯特菌(L(L isteria mmonocytogenes)isteria mmonocytogenes)、大肠杆菌、大肠杆菌(Escherichia coli)ETE
10、C:44247(6:15:16)Escherichia coli)ETEC:44247(6:15:16)、EPEC:44706(111:58)EPEC:44706(111:58)、单增李斯特菌、单增李斯特菌(L(L isteria m onocytogenes)isteria m onocytogenes),蜡状芽孢杆菌,蜡状芽孢杆菌(B(B acillus cereus)acillus cereus)、瑞士乳杆菌、瑞士乳杆菌(Lactobacillus(Lactobacillus helveticus )helveticus )、乳酸乳球菌、乳酸乳球菌(Lactococcus(Lactoco
11、ccus lactis)lactis)、嗜热链球菌、嗜热链球菌(S treptococcus therm(S treptococcus therm ophilus KLDS)ophilus KLDS)、双歧杆菌、双歧杆菌(Lactobacillus bif(Lactobacillus bif idus KLDS)idus KLDS),B stDNA B stDNA 聚合酶聚合酶(New England B(New England B iolab)iolab)、DNA markerDL2000DNA markerDL2000仪器:仪器:DYY-10C DYY-10C型电泳仪型电泳仪 UVPUVP
12、凝胶成像仪凝胶成像仪2.2.实验方法实验方法 DNA DNA模板的制备模板的制备 煮沸法将对数生长期的金黄色葡萄球菌等细菌培养物煮沸法将对数生长期的金黄色葡萄球菌等细菌培养物,取取1mL 1mL 于于EPEP管中管中12000 r/min,12000 r/min,离心离心5min 5min 收集菌体收集菌体,加入加入TE-TE-Trinton200LTrinton200L混匀后混匀后,于沸水中于沸水中5min,5min,后后12000 r/min 12000 r/min 离心离心5min,5min,取上面取上面50L50L作为作为LAMPLAMP扩增及扩增及PCRPCR扩增反应的模板。另用试扩
13、增反应的模板。另用试剂盒提取标准金黄色葡萄球菌剂盒提取标准金黄色葡萄球菌DNADNA备用。备用。引物的设计与合成引物的设计与合成 根据金黄色葡萄球菌根据金黄色葡萄球菌femAfemA基因基因,应用应用PrimerExp lorer 3 PrimerExp lorer 3 设计特异引物设计特异引物,包括两条外引物包括两条外引物F3F3、B3,B3,内引物内引物F IPF IP、B IPB IP。LAMP LAMP反应及条件的优化反应及条件的优化 LAMP LAMP反应:反应:配置反应体系为配置反应体系为25L,25L,包括包括:018mmol/L:018mmol/L FIP,018mmol/L
14、B IP,012mmol/L F3,012mmol/L B3,FIP,018mmol/L B IP,012mmol/L F3,012mmol/L B3,116mmol/L dNTPs,018mmol/L betaine,4mmol/L MgSO4,116mmol/L dNTPs,018mmol/L betaine,4mmol/L MgSO4,20mmol/L Tris-HCl(pH818),10mmol/L KCl,10mmol 20mmol/L Tris-HCl(pH818),10mmol/L KCl,10mmol/L(NH4)2 SO4,2L DNA/L(NH4)2 SO4,2L DNA
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