DB37∕T 4030-2020 苹果品种鉴定方法 微卫星方法.doc
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1、ICS07.080B 30/39DB37山东省地方标准DB37/T 40302020苹果品种鉴定方法微卫星方法Molecule identification method for apple strain2020 - 07 - 09发布2020 - 08 - 09实施山东省市场监督管理局发布前言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由青岛海关提出、归口并组织实施。本标准起草单位:青岛海关技术中心、临沂大学、中国农业科学院果树研究所、中国科学院海洋研究所。本标准主要起草人:高宏伟、刘云国、陈新疆、王强、王鸿霞、陈盛盛、孙雯娴、孙敏、魏晓棠。本标准系首次发布。苹果品种鉴定方法微卫
2、星方法1 范围本标准规定了苹果品种的分子鉴定方法。本标准适用于由苹果的种苗、砧木、枝叶、果实等组织鉴定苹果品种。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 19557.1植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南总则NY/T 24242013植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南苹果3 术语和缩略语3.1 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1.1 品种cultivar在一定的生态和经济条件下,经自然或人工选择形成的动、植物群体。在植物学里,品种是
3、在植物界的22个分类等级之下,具有相对的遗传稳定性和生物学及经济学上的一致性,并可以用普通的繁殖方法保持其恒久性。 3.1.2PCR多聚酶链式反应polymerase chain reaction以拟扩增的DNA分子为模板,以末端互补的寡核苷酸片段为引物(primer),在耐热DNA聚合酶的作用下,按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA分子合成。重复这一过程,即可使目的DNA片段得以大量扩增。是常规分子生物学技术之一,用于扩增特定的DNA片段。3.1.3基因座位(或位点)genetic locus基因在染色体上占有的特定位置叫基因位点。3.1.4微卫星序列microsatelli
4、te又称为短串联重复序列(short tandem repeats,STRs)或简单重复序列(simple sequence repeats),是均匀分布于真核生物基因组中的简单重复序列,由26个核苷酸的串联重复片段构成,由于重复单位的重复次数在个体间呈高度变异性并且数量丰富,因此微卫星标记的应用非常广泛。微卫星位点通常通过PCR扩增,扩增产物通过电泳分析并根据大小分离等位基因进行检测。3.1.5等位基因allele指位于一对同源染色体相同位置上控制同一性状不同形态的基因。3.2 缩略语下列缩略语适用于本文件。bp:碱基对(base pair) CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(Hexadecy
5、l trimethyl ammonium Bromide)DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonuleic acid)EDTA:乙二胺四乙酸(Ethylene Dia mine Tetraacetic Acid)Tris:三羟甲基氨基甲烷(2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol)4 原理不同苹果品种间SSR基因座位的等位基因存在序列长度多态性,即苹果品种间微卫星序列(SSR)依苹果品种不同,等位变异的数量可能不同。针对特定SSR两侧序列高度保守的核酸序列,设计序列特异性引物,利用PCR技术对重复序列进行扩增,并对PCR扩增引物进行硝酸银染色或者荧
6、光染料标记定量区分片段大小(bp),根据该等位变异的扩增片段大小鉴定苹果品种,在苹果品种鉴定的数据库中进行比对,从而鉴定苹果品种。5 设备和材料5.1 设备5.1.1 天平:感量0.01 g。5.1.2 均质器。5.1.3 水浴锅(0 100 ,感量0.1 )。5.1.4 振荡器。5.1.5 研钵或其他粉碎装置。5.1.6 高速台式冷冻离心机。5.1.7 梯度PCR仪。5.1.8 微量可调移液器及配套吸头(50 L、100 L、200 L)。5.1.9 微量离心管(1.5 mL和2 mL)。5.1.10 毛细管电泳仪或者DNA分析仪。5.2 试剂5.2.1 CTAB提取缓冲液:55 mmol/
7、L CTAB,1 400 mmol/L NaCl,20 mmol/L EDTA,100 mmol/L Tris,用10 % 盐酸调pH至8.0,121 ,高压灭菌20 min,备用。5.2.2 CTAB沉淀液:称取1.00 g CTAB,0.50 g NaCl,用适量水溶解后,调节pH=8.0,定容至200 mL,高压灭菌。5.2.3 RANase RNA酶。5.2.4 TE缓冲液(pH 8.0)。5.2.5 NaCl溶液,1.2 mol/L。5.2.6 三氯甲烷。5.2.7 异丙醇。5.2.8 70 %乙醇。5.2.9 引物:根据附录A中表A.1的序列合成荧光引物,加超纯水配制成100 pm
8、ol/L储存液,用于PCR检测的工作液浓度为10 pmol/L。荧光基团可以为FAM、HEX中的一种。5.2.10 毛细管电泳专用分子量内标。5.2.11 去离子甲酰胺。5.2.12 除特别说明外,所用试剂均为分析纯。水为无离子水。5.2.13 蛋白酶K。5.2.14 苯酚。6 制样对于种苗、枝叶、果实样品,每个样品取两个平行样,各300 mg。对于砧木样品取韧皮部部分,每个样品取两个平行样,各300 mg。7 检测方法7.1 样品DNA的提取7.1.1 称取300 mg经的样品,液氮研磨后置于2 mL离心管中,加入600 L CTAB缓冲液和40 L蛋白酶K,振荡混匀,65 温浴30 min
9、90 min,期间每隔10 min 轻柔颠倒混匀。7.1.2 2 000 g离心5 min,取上清于另一干净的2 mL离心管中,加入等体积的酚、三氯甲烷和异戊醇的混合液(25:24:1),震荡混匀。7.1.3 12 000 g离心10 min,取上清至干净的2 mL离心管中,加入等体积异丙醇,颠倒混匀。7.1.4 12 000 g离心10 min,弃去上清液,用预热至65 的TE缓冲液溶解DNA。7.1.5 加入5 L RNA酶溶液,37 30 min。7.1.6 加入200 L三氯甲烷:异戊醇(24:1),强烈振荡。7.1.7 12 000 g离心10 min,取上清至干净的2 mL离心管中
10、,加入等体积异丙醇,颠倒混匀。7.1.8 12 000 g离心10 min,弃去上清液,用4 预冷的70 %乙醇500 L,涡旋清洗沉淀。7.1.9 12 000 g离心10 min,弃去上清液,倒置晾干后加100 L TE缓冲液溶解沉淀,20 保存备用。也可以根据实际情况使用其他经过验证的试剂盒。7.2 DNA浓度与纯度测定采用紫外分光光度计法测定DNA浓度和纯度。紫外分光光度计检测的最佳范围是2 pg/mL50 pg/mL,OD值应该在0.051的区间内。将DNA液做适当的稀释,放入紫外分光光度计的龀色皿中,于260 m处测定其吸收峰,1OD260 nm=50 g/mL双链DNA或38,g
11、/mL单链DNA。PCR级DNA溶液的OD260 nm/OD280 nm比值为1.72.0。7.3 PCR定性检测7.3.1 PCR反应引物序列表针对种常见苹果品种鉴定用的PCR扩增引物,见附录A中表A.1。15对引物分别进行PCR的扩增。7.3.2 PCR反应参数PCR扩增用引物序列信息见附录A中表A.1。7.3.3 PCR反应体系PCR反应体系见附录A中表A.2。7.3.4 质控措施检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。用已知品种的苹果做阳性对照,用已知不含苹果成分的模板作阴性对照,用等体积的水代替模板DNA作空白对照。7.4 毛细管电泳荧光检测7.4.1 样品上机按照毛细管电泳仪
12、器使用要求更换缓冲液、灌胶和在程序中输入样品信息。将FAM荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍,将HEX荧光标记的PCR产物用超纯水稀释15倍,将TAMRA荧光标记的PCR产物用超纯水稀释10倍,将ROX荧光标记的PCR产物用超纯水稀释5倍,混合均匀。从稀释液中取1 L上样到毛细管电泳仪专用分析板的孔中。同时加入0.1 L分子量内标和8.9 L去离子甲酰胺。将样品在PCR仪上95 变性5 min,迅速取出置于冰上,冷却10 min。离心把管内液体甩至管底后上毛细管电泳的仪器。 启动运行程序,毛细管电泳仪自动收集点用数据。7.4.2 等位数据采集由毛细管电泳的分析软件,通过与标准分子量比对,读
13、出每个扩增位点的样品等位基因扩增条带数目和条带大小的数据。若采集的等位基因扩增的数据为2个扩增条带,则该样品为二倍体苹果。若采集的等位基因扩增的数据为3个扩增条带,则该样品为三倍体苹果。若有4个扩增条带,则该样品为四倍体苹果。二倍体纯合位点的等位基因条带的大小数据记录为X/X,杂合位点等位变异大小数据记录为X/Y。其中X、Y分别为该位点上两个不同的等位变异,小片段数据在前,大片段数据在后,无效等位变异的大小记录为0/0。三倍体和四倍条带大小记录方式类推。7.5 结果判定及表述7.5.1 将获得样品的等位基因变异数据与附录A.3数据库中品种比较:a) 若为二倍体,品种相似度(S)按照下面的公式计
14、算:(1)式中:S 相似度,单位为百分率(%);Nij 品种i和j之间共有的等位基因数目;Ni 品种i中出现的等位基因数目;Nj 品种i中出现的的等位基因数目。b) 若为三倍体,品种相似度(S)按照下面的公式计算:(2)式中:S 相似度,单位为百分率(%);Nij 品种i和j之间共有的等位基因数目;Ni 品种i中出现的等位基因数目;Nj 品种i中出现的的等位基因数目。推荐使用本标准附录B配用的苹果品种鉴定系统软件,该软件预装了附录A.3的标准样品数据库,并且按照以上公示设计计算程序,输入待测样品的微卫星数据,运行程序可以直接得到品种相似度最高的相似品种信息。该软件需要在Java运行条件下安装使
15、用。7.5.2 结果判定及表述判定方法如下:a) 品种间相似度90 %,判定为不同品种;b) 品种间相似度90 %S100 %时,判定为近似品种;c) 品种间相似度=100 %,判定为疑似品种。对于b)和c)的情况,按照GB/T 19557.1和NY/T 24242013的规定进行田间鉴定。AA附录A (规范性附录)PCR扩增用引物序列信息及参考数据库PCR扩增用引物序列信息见表A.1。表A.1 PCR扩增用引物序列信息序号名称引物方向序列(5-3)5端标记荧光基团扩增条件扩增大小bp文献来源1CH01d08Fctccgccgctataacacttc94 2 min 30 sec; 94 30
16、 sec,52 30 sec,72 30 sec,40 cycle;72,10 min。238-2901、Gerald S. Dangl Judy Yang Deborah A. Golino Thomas Gradziel. A practical method for almond cultivar identificationand parental analysis using simple sequence repeat markersEuphytica (2009) 168:4148.2、L. Gianfranceschi, N. Seglias,R. archini, M. Ko
17、mjanc, C. Gessler. Simple sequence repeats for the genetic analysis of apple. Theor Appl Genet (1998) 96:1069-1076.Ractctggagggtatgtcaaag2CH01e01Fggttggagggaccaatcatt106-120Rcccactctctgtgccagatc3CH02b03bFataaggatacaaaaaccctacacag77-109Rgacatgtttggttgaaaacttg4CH02b07Fccagacaagtcatcacaacactc180-202Rat
18、gtcgatgtcgctctgttg5CH02b10Fcaaggaaatcatcaaagattcaag121-159RCaagtggcttcggatagttg6CH02b12Fggcaggctttacgattatgc101-143Rcccactaaaagttcacaggc7CH02d11Fagcgtccagagcaacagc118-148Raacaaaagcagatccgttgc8CH02f06Fccctcttcagacctgcatatg135-158Ractgtttccaagcgatcagg9CH02g09Ftcagacagaagaggaactgtatttg98-138RCaaacaaacc
19、agtaccgcaa10CH02h11aFcgtggcatgcctatcatttg104-132Rctgtttgaaccgcttcctc11CH03d07Fcaaatcaatgcaaaactgtca186-226Rggcttctggccatgatttta12CH04d02Fcgtacgctgcttcttttgct118-146Rctatccaccacccgtcaact13CH04d10Fgagggatctgtagctccgac138-204Rtggtgagtatctgctcgctg14CH05c07Ftgatgcattagggcttgtactt111-149Rgggatgcattgctaaat
20、aggat15CH05g03Fgctttgaatggatacaggaacc135-192RcctgtctcatggcattgttgPCR反应体系见表A.2。表A.2 PCR反应体系试剂名称工作液浓度25 L反应体系加样体积/ LdNTP2.5 mmol/L2 LPCR缓冲液102.5 LTaq DNA聚合酶5 U/L0.3 L上游引物10 pmol/L0.3下游引物10 pmol/L0.3DNA模板10050 ng2超纯水17.6部分苹果品种SSR基因型数据见表A.3。表A.3 部分苹果品种SSR基因型数据品种果实或者茎枝SSR位点CH02b12SSR位点CH01e01SSR位点CH02b03
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