MALDITOFMS在细菌检测中的应用.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,中南大学湘雅三医院,*,单击此处编辑母版标题样式,MALDI-TOF-MS,在细菌检测中的应用,2,一、,现有的细菌检测方法及其缺陷,3,现有的细菌检测方法及其缺陷,经典方法,初步分类：菌落形态、显微镜检查、以及趋向性试验，如革兰染色、氧化酶和触酶。,鉴定属或种：以细菌生长代谢过程为基础的特征性的生理生化反应、选择培养基生长情况。,缺陷,虽然某些生化试验只需要数分钟即可完成，但对于绝大多数经过转种、培养的微生物标本，通常要得到一个完整的,鉴定报告大约要,24-48h,，某些苛氧菌或生长慢的细菌则耗时更多。,操作繁琐、主观性强。,4,现有的细菌检测方法及其缺陷,分子生物学方法,1.,细菌核糖体（,16S rRNA,）基因序列分析：,rRNA,寡核苷酸序列是细胞中最稳定的序列，比,DNA,稳定的多。,细菌中有三种,rRNA,，,23S,、,16S,和,5S,，其中,16S rRNA,因其核苷酸数目适中、信息量大、具有高度稳定性、易于提取和分析而成为理想的细菌鉴定的研究对象。,通过分析比较细菌,rRNA,序列的相关性确定细菌种系的发生关系。,5,现有的细菌检测方法及其缺陷,分子生物学方法,2.,其他：,鸟嘌呤加胞嘧啶碱基比例的测定,(G+C mol%),，,核酸的分子杂交,实时荧光定量,PCR,缺陷：,技术复杂、耗费高、假阳性率高、不能自动化、高通量。,不适合临床常规检测！,6,迫切需要找到一种新的病原微生物快速诊断的方法，以满足临床需要,7,现有的细菌检测方法及其缺陷,二、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱,8,（一）质谱的基本概念,9,质谱的基本概念,质谱法,(Mass Spectrometry,MS),：,定义：用电场和磁场将运动的离子（带电荷的原子、分子或分子碎片，）按它们的质荷比分离后进行检测的方法。,没有两个核素的质量是一样的，也没有一种核素的质量恰好是另一种核素质量的整数倍。,分析这些离子可获得化合物的分子量、化学结构、裂解规律等信息。,10,原理：,使样品中各组分电离生成不同质荷比的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器。,利用电场和磁场使其发生相反的速度色散，离子束中：,速度慢的离子通过电场后偏转大，速度快的偏转小,速度慢的离子在磁场中偏转较大，速度快的偏转小,在磁场中还能发生质量的分离，使,不同质荷比的离子聚焦在不同的点上，,将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量。,11,质谱的基本概念,仪器：,利用运动离子在电场和磁场中偏转原理设计的仪器称为质谱计或质谱仪。,质谱计指用电子学方法检测离子，而,质谱仪,指离子被聚焦在照相底板上进行检测。,质谱法的仪器种类较多。,有单聚焦质谱计、双聚焦质谱计和四极矩质谱计等。,后两种用得较多，而且多与气相色谱仪和电子计算机联用。,12,质谱的基本概念,高真空系统：,质谱计必须在高真空下才能工作。,高真空的阀泵系统一般由前级泵（常用机械泵）和油扩散泵或分子涡轮泵等组成。,扩散泵能使,离子源,保持在,10,-6,10,-7,毫米汞柱的真空度。,在,分析器,中还有一只扩散泵，能维持,10,-7,10,-8,毫米汞柱的真空度。,13,质谱的基本概念,样品注入系统：,可分直接注入、气相色谱、液相色谱、气体扩散四种方法。,固体样品通过直接进样杆将样品注入，加热使固体样品转为气体分子。,对不纯的样品可经气相或液相色谱预先分离后，通过接口引入。,液相色谱,/,质谱接口有传动带接口、直接液体接口和热喷雾接口。,14,质谱的基本概念,离子源：,使样品电离产生带电粒子（离子）束的装置。,应用最广的电离方法是电子轰击法（,EI,）。,还有化学电离（,CI,）、光致电离、场致电离、激光电离、火花电离、表面电离、,X,射线电离、,场解吸电离,（,desorption ionization,）,和快原子轰击电离等。,其中场解吸和快原子轰击特别适合测定挥发性小和对热不稳定的化合物。,15,质谱的基本概念,质量分析器：,将离子源中形成的离子束按质荷比的大小进行分离的装置。,它的结构有单聚焦、双聚焦、四极矩、飞行时间（,Time of Flight,TOF,）和摆线等。,16,质谱的基本概念,收集器：,经过分析器分离的同质量离子可用照相底板、法拉第筒或电子倍增器收集检测。,质谱仪的分辨率和灵敏度等性能非常高，只需要,ug,甚至,ng,级的样品，就能得到一张满意的质谱图。,对于微量不纯的化合物，可以利用气相色谱或液相色谱（对极性大的化合物）将化合物分离成单一组分，导入质谱计，录下质谱图。,17,质谱的基本概念,应用：,由于色谱仪质谱计联用后给出的信息量大，该法与计算机联用，使质谱图的规格化、背景或柱流失峰的舍弃、元素组成的给出、数据的储存和计算、多次扫描数据的累加、未知化合物质谱图的库检索，以及打印数据和出图等工作均可由计算机执行，大大简化了操作手续。,质谱法特别是它与色谱仪及计算机联用的方法，已广泛应用在有机化学、生化、药物代谢、临床、毒物学、农药测定、环境保护、石油化学、地球化学、食品化学、植物化学、宇宙化学和国防化学等领域。,18,质谱的基本概念,纯化,离子分离,分析,质谱仪：,质谱仪种类繁多，不同仪器应用特点也不同。,在,300,左右能汽化的样品，可以优先考虑用,GC-MS,进行分析，因为,GC-MS,使用电子轰击法电离源（,EI,源），得到的质谱信息多，可以进行库检索。,在,300,左右不能汽化，需要用,LC-MS,分析，此时主要得到分子量信息，如果是串联质谱，还可以得一些结构信息。,如果是,生物大分子,，主要利用,LC-MS,和,MALDI-TOF,分析，主要获得分子量信息。对于蛋白质样品，还可以测定氨基酸序列。,19,质谱的基本概念,质谱仪：,质谱仪的分辨率是一项重要技术指标，高分辨质谱仪可以提供化合物组成式，这对于结构测定是非常重要的。,双聚焦质谱仪，傅立叶变换质谱仪，带反射器的,飞行时间质谱仪,等都具有高分辨功能。,20,质谱的基本概念,21,质谱的基本概念,质谱仪,（二）基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱,22,1.,什么是,MALDI-TOF-MS,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（,Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry,）,最近发展起来的一种质谱技术，能够提供各具特征的微生物蛋白质质量指纹图谱，通过检索特征性质质谱峰数据库或与已知微生物的质谱峰比较，来实现对微生物的快速鉴定,具有快速、高灵敏度、高分辨率等优点，能够对核酸、蛋白质和多肽等生物大分子进行微量分析,.,23,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱,2.,主要概念,MALDI,（,Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization,）,是一种直接气化并离子化非挥发性生物样品的质谱离子化方式。,将被分析物的溶液和某种基质溶液混合，蒸发溶剂，使被分析物与基质成为晶体或半晶体，,再用一定波长的脉冲式激光进行照射，基质吸收激光能量后，均匀地传递给待分析物，使待分析物瞬间气化并离子化。,使用基质的主要目的是保护待分析物不会因为过强的激光能量导致化合物被破坏。,24,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱,2.,主要概念,TOF,（,Time Of Flight,），飞行时间分析器：,具有相同动能，不同质量的离子，因其飞行速度不同而分离。,如果固定离子飞行距离，则不同质量离子的飞行时间不同，质量小的离子飞行时间短而首先到达检测器。,25,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱,3.,基本原理：,将微生物与等量的基质分别点在加样板上，溶剂挥发后形成样品和基质的共晶体,基质从激光中吸收能量使样品解吸，基质与样品之间发生电荷转移使得样品分子电离,经过飞行时间检测器，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测。,即通过测定离子的质荷比（,M/Z,）与离子的飞行时间成正比来检测离子的分子量,通过专用软件分析比较，确定出特异性的指纹图谱,26,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱,27,MALDI-TOF-MS,原理图,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱,三、,MALDI-TOF-MS,在临床微生物中的应用,28,基于,细菌表面蛋白分子量,检测的,MALDI-TOF-MS,技术是一种全新的微生物快速检测和鉴定技术。,通过测定细菌自身独特的蛋白质组成，应用质谱技术将测得的蛋白质和多肽按分子量大小排列，形成独特的,蛋白质组指纹图,，通过特征性的模式峰进行菌株的鉴定。,29,MALDI-TOF-MS,在临床微生物中的应用,（一）简要操作流程,1.,制备基质溶液,2.,样品的制备,3.,质谱分析,4.,数据分析,30,MALDI-TOF-MS,在临床微生物中的应用,制备基质溶液：,常用的基质有图示的,4,种。,基质种类可能影响质谱峰的形成。,有研究表明，,DHB 50 mg/mL,，,31,50%,乙腈，,0.1%,三氟乙酸为基质，检测液体培养细菌，可获得最佳质谱图。,现已有商品化的配套基质溶液可以购买。,MALDI-TOF-MS,在临床微生物中的应用,2.,样品的制备,（,A,）直接挑菌落涂片（,75%,90%,）,（,B,）乙醇,/,乙晴处理（,10%,20%,）,临床标本接种于培养基（液体或固体）,挑取菌落或取液体培养液，经水和乙醇处理,再经,70%,甲酸,/,乙腈（,1,：,1,）处理,32,MALDI-TOF-MS,在临床微生物中的应用,3.,质谱分析,取一定量样品上清液点加到靶盘上，晾干后再点等量基质（如,CHCA,等），放干后进行,MALDI-TOF-MS,分析,脉冲激光、模式、加速电压、激光强度等参数还未获得一个统一的模式，需要优化。,33,MALDI-TOF-MS,在临床微生物中的应用,E,kin,=1/2mV,2,4.,数据分析,通过软件处理质谱图，并进行主成分分析,*横坐标为质荷比（,m/z,），纵坐标为吸收峰强度,34,MALDI-TOF-MS,在临床微生物中的应用,35,MALDI-TOF-MS,在临床微生物中的应用,简要操作流程,36,（二）,MALDI-TOF-MS,在细菌检验中的应用范围,细菌菌种鉴定,多血清型细菌鉴定,耐药性不同的菌株鉴定,真菌的鉴定,血液、尿液及其他无菌液体标本的鉴定,粪便标本的鉴定,MALDI-TOF-MS,在细菌检验中的应用范围,1,、细菌菌种鉴定,Eigner,等应用细菌菌落直接检测上千株代表临床微生物实验室主要分离的细菌，,能准确鉴定,95.2%,。,Seng,等研究,1066,株分离细菌菌株，代表,109,个不同的种，,84.1%,能准确鉴定到种，,11.3%,只能鉴定到属,。,Bizzini,等分析,1371,株临床分离株发现,93.2%,能鉴定到种水平，,5.3%,到属水平,。在鉴定到种的水,，,MS,和传统生化方法平一致率为,95.1%,。,37,MALDI-TOF-MS,在细菌检验中的应用范围,1,、细菌菌种鉴定,在鉴定非发酵菌方面，用人类感染相关的,37,个属的,248,株非发酵菌建立数据库，测定,80,株临床分离菌，并且和,16S rRNA,基因序列分析比较。,MS,能鉴定,67,株（,85.9%,）,，,9,株鉴定错误，,2,株不能鉴定。,结论：,MALDI-TOF-MS,能准确、可重复地鉴定细菌且在,10min,内，不需要其他的耗材。,结果错误或不能鉴定是由于,MALDI-TOF-MS,数据库不完善，大部分的差异是因为系统数据库相关的分类学差异。,38,2,、多血清型细菌的鉴定,传统的细菌培养和生化鉴定方法无法对沙门氏菌、大肠埃希氏菌、霍乱弧菌和副溶血性弧菌等多种与人类健康密切相关的多血清型病原菌进行分类，需要进一步采用血清学或噬菌体试验等技术。,应用,MALDI-TOF-MS,技术对这些多血清型细菌进行鉴定和分类得到了初步应用，在沙门氏菌分型中表现出较好的分型能力。,39,MALDI-TOF-MS,在细菌检验中的应用范围,3,、耐药性不同的菌种,一些研究表明,MALDI-TOF-MS,可以快速区分凝固酶阳性和凝固酶阴性的金黄色葡萄球菌,美国范德堡大学和英国曼切斯特大学的研究发现,MALDI-TOF-MS,可部分,替代甲氧西林或头孢西丁纸片法检测耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（,MRSA,）,可以用,MALDI-TOF-MS,检测,针对抗菌剂分子的细菌各种获得性酶,，如,-,内酰胺酶、甲基化酶、质子泵等。,40,MALDI-TOF-MS,在细菌检验中的应用范围,4,、真菌,MALDI-TOF-MS,可用来鉴定酵母菌、酵母样菌、丝状霉菌。,Marklein,等研究表明，,250,株临床分离的念珠菌，包含,15,个种，,96%,可准确鉴定,。,5,、血液、尿液及其他无菌液体标本,应用血清分离管或氯化铵溶血标本，,MS,直接鉴定,79%,的单一细菌感染。,MS,对尿液标本中的细菌快速、准确，尤其是大肠埃希菌，正确鉴定率为,97.6%,。,也有研究应用,MS,直接检测和鉴定其他正常无菌液体中的细菌，正确鉴定率为,96%,。,41,MALDI-TOF-MS,在细菌检验中的应用范围,6,、粪便标本,直接从粪便选择培养基上生长的可疑菌落进行,MALDI-TOF-MS,分析，从而对常规引起腹泻的致病菌进行快速鉴别与鉴定。,该方法可提前,2,3d,对大多数非乳糖发酵正常菌群，如大肠埃希菌、枸橼酸杆菌、变形杆菌、阴沟肠杆菌、摩根菌等做出准确判定。,42,MALDI-TOF-MS,在细菌检验中的应用范围,快速检测耐甲氧西林金葡菌,（,MRSA,）,（三）,MALDI-TOF-MS,应用举例,43,1.,配制基质溶液,最佳基质溶液是,50mg/mL DHB+50%,乙腈,+0.1%,三氟乙酸（,TFA,）。,2.,制备样品,所有菌株按照,1%,的比例接种于,5mL LB,培养基中,在,37,恒温培养振荡器中培养,8h,。,取,1mL,培养液,6000,g,离心,3min,收集菌体,用,75%,乙醇溶液灭活,离心去上清。,用超纯水将菌体洗涤,2,次,最后用,1mL,超纯水重悬菌体。,取,1,L,细菌重悬液与,1,L,基质溶液充分混合后点样,室温干燥。,44,MALDI-TOF-MS,应用举例,3.,质谱分析,选用配置脉冲氮激光,(337nm),离子源的,Ultraflex,串联质谱仪,线性模式,正离子谱测定,加速电压控制在,22kV,。,每个样品随机选择,10,个不同的点,累击,2000,次,相对激光强度为,40%,扫描范围,2000,20000Da,。,用,1pmol,的标肽和标准蛋白混合物对系统进行校正,使误差,0.1%.,4.,数据分析,通过,FlexAnalysis3.0,软件处理质谱图,包括质谱图的平滑、衰减及标峰处理,(,信噪比大于,5),。,通过,ClinProTool,TM,2.1,软件进行主成分分析。,45,MALDI-TOF-MS,应用举例,根据主成分分析,可以对一套谱图进行自动多变量分析。对,11,株细菌分别进行培养检测,每株细菌重复点,3,个靶点,应用主成分分析能够将实验中的,3,种细菌明显地区分开。,46,a,：大肠杆菌；,b,：志贺氏菌；,c,：副伤寒沙门氏菌,MALDI-TOF-MS,应用举例,MALDI-TOF-MS,所得质谱图,47,A,B,大肠埃希菌,志贺氏菌,副伤寒沙门氏菌,混合菌群,快速检测耐甲氧西林金葡菌,（,MRSA,）,（四）,MALDI-TOF-MS,方法学评价,48,1.MALDI-TOF-MS,的优势与特点,准确度高,鉴定到菌种甚至血清型，准确度达,90%,以上,灵敏度高：可达到,fmol,级,快速：检测只需几分钟,可高通量筛选：可进行几十到几百个样本同时点样,受样本中杂质的影响较小,无需预先培养或分离，可直接进行检测,49,MALDI-TOF-MS,方法学评价,2.MALDI-TOF-MS,目前的局限性,基质的选择、基质溶剂的组成样品的处理及样品的上样方式,细菌不同的培养基、培养时间及用菌量,尚未形成一种成熟的、通用的标准化实验操作规程,所适用的检测细菌仍然有一定的限制,方法的准确性依赖于数据库中菌种的信息量，目前国内菌种数据库中的质谱分析图谱量较少，限制了检测的准确性,50,MALDI-TOF-MS,方法学评价,3.MALDI-TOF-MS,的展望,目前国内尚未完善各种细菌菌株的质谱图数据库。,数据库中的谱图绝大多数都是国外菌株的资料，而且不同国家和地区的菌株可能存在明显的地理差异。,需要采用国内分离的菌株尽快建立适合我国各种细菌检测和鉴定的谱图数据库，并不断增加数据库的菌株种类和数量，才能保证该技术应用的准确性。,该技术对不同菌株的检测灵敏度和准确性、多血清型细菌的分型鉴别准确性以及样品处理、质谱图采集和分析等，还有许多问题需要研究和改进。在试验方法的标准化方面也需要深入探讨。,51,MALDI-TOF-MS,方法学评价,52,