分子克隆工具酶.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,分子克隆工具酶,The enzymes in the molecular cloning,Chapter 7,Chapter7 分子克隆工具酶,限制性核酸内切酶,(,特异性切割,),甲基化酶,(DNA,分子的甲基化,),DNA,聚合酶,(,合成,DNA),其他分子克隆工具酶,(,细胞破壁、核酸纯化等,),第一节 限制性内切酶,1.限制与修饰现象,限制酶的发现,命名：,宿主,属名,第一个字母,(,大写,),+,种名,头两个字母,(,小写,),+,菌株,号,+,罗马序号,一、限制与修饰,the,1,st,such,enzyme found,E,scherichia,co,li,Species category,R13,strain,How to name a restriction endonuclease?,Eco,RI,限制与修饰系统的种类,II（93%）,I（1%）,III（1%）,酶分子,内切酶与甲基化酶分子不在一起,三亚基双功能酶,二亚基双功能酶,识别位点,4-6bp，大多数回文对称,二分非对称,5-7bp非对称,切割位点,在识别位点中或靠近识别位点,无特异性，在识别位点外1000bp,在识别位点下游24-26bp,限制反应与甲基化反应,分开的反应,互斥,同时竞争,限制反应是否需要ATP,否,是,是,5内切酶,3内切酶,ds-DNA结构:切口,缺口,断口,缺口(gap)切口(nick)断口(cut),3,HO P5,3,HO P5,Consider a linear DNA molecule with,6,copies of,GAATTC,:,it will be cut into,7,fragments which could be separated by the gel electrophoresis.,(The largest fragment),(The smallest fragment),digestion of a DNA fragment with endonuclease,Eco,RI,A given molecule will generate a characteristic series of pattern when digested with a set of different enzymes.,e.g.the combination of,Eco,RI,+,Hind,III,Use of multiple REs allows different regions of a DNA molecule to be isolated,(1)Restriction enzymes differ in the recognition specificity:,target sites are different,.,(2)Restriction enzymes differ in,the length they recognized,and thus,the frequencies differ,.,Differences of REs,sticky ends,(,粘性末端,),blunt ends,(,平末端,),Recognition sequences and cut sites of various endonucleases,Cleavage of an,Eco,RI site.,The 5 protruding ends are said to be“sticky”because they readily anneal through base-pairing to DNA molecules cut with the same enzyme,(1)同序同切酶,这些酶识别序列和切割位置都相同。,Hind与Hinc 识别切割位点为,GTYRAC,(Y为C或T，R为A或G),Hpa与 Hap 识别切割位点为,CCGG,Mob与 Sau3A识别切割位点为,GATC,4、同裂酶(isoschizomer)：识别相同序列的限制酶称为同裂酶，但切割位点可能不同。,(2),同序异切酶,Kpn 和 Acc65 识别的序列是相同的，但它们的切割位点不同，分别为：,Kpn：,GGTACC,Acc65：,GGTACC,4、同裂酶(isoschizomer),(3),“同功多位”许多识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能,。,如 EcoR识别和切割位点为,GAATTC,Apo 识别和切割位点为,RAATTY,后者可识别前者的序列。,4、同裂酶(isoschizomer),(4),其它有些限制酶识别的序列有交叉,。,如在 pUC 系列质粒的多克隆位点中有一个,Sal位点（识别切割位点为,GTCGAC,），该位点也可被,Acc位点（识别切割位点为,GTMKAC,）和Hinc位点（识别切割位点为,GTYRAC,）切割。,4、同裂酶(isoschizomer),5、同尾酶(isocaudarner),不同的 限制酶切割DNA产生的末端是相同的，且是对称的，即它们可产生相同的黏性末端。,BamH I:,G,GATCC,Bgl II :,A,GATCT,6、,归位内切酶(homing endonuclease),内含子编码的内切酶。,对同一底物中的有些位点表现出偏爱性切割，导致其对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率。,1、酶切位点对酶的敏感性不同，,2、在切割相同量的不同DNA时所需要的酶量是不同的。,五、位点偏爱(site preference),缓冲液：,pH,、,Mg,2+,、,DTT,、,BSA,反应温度：大多数,37,反应时间：,1-2h,终止酶切的方法：,EDTA,、加热、苯酚抽提去除蛋白、试剂盒纯化,DNA,。,六、酶切反应条件,在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列。,1、引起星星活性的因素：甘油浓度过高，酶过量，离子强度低，pH过高等。,2、抑制方法：减少甘油浓度，减少酶的用量，提高离子强度，降低pH，保证反应体系无有机溶剂等。,七、星星活性(star activity),1、将产生的5突出末端补平后，再连接可产生新的酶切位点。,2、同尾末端的连接：不同的同尾酶切割DNA产生的末端再相互连接时，可产生新的酶切位点，同时原来的酶切位点消失。,3、平末端连接产生新的酶切位点,Pvu II(,CAGCTG,)+EcoR V(,GATATC,),Mbo I:,GATC,九、酶切位点的引入,1、外部因素(可预见和控制),反应条件、底物纯度、酶量、反应体积、反应时间等,2、内部因素,星星活性、底物甲基化和底物的构象(切割线性DNA和超螺旋DNA的活性差异),十、影响酶活性的因素,2、Dcm甲基化酶。识别CCAGG或CCTGG序列，在第二个胞嘧啶C的C,5,位置引入甲基。受Dcm甲基化作用影响的酶有EcoRII(CCWGG)，但其同裂酶不受影响，因其切点不同。,3、,Eco,K I甲基化酶，其识别位点少，识别AAC(N),6,GTGC和GCAC(N),6,GTT序列中A的N,6,位置。,4、,Sss,I甲基化酶，来源于原核螺原体，可使CG序列中的C在C,5,位置上甲基化。,一、甲基化酶的种类(methylase),二、依赖于甲基化的限制系统,1、,E.coli,：McrA，McrBC和Mrr，识别序列不同，但只识别经过甲基化的序列，都限制由CG甲基化酶(M.SssI)作用的DNA。,McrA：限制HpaII甲基化修饰的位点。,McrBC：限制两套半位点(G/A),m5,C。,Mrr：限制,m6,A。,三、甲基化对限制酶酶切的影响,修饰酶切位点,主要使酶切位点甲基化，而不受限制性核酸内切酶的切割。,2.,产生新的酶切位点,有些酶是依赖甲基化的限制酶，因此甲基化后可产生新的酶切位点。,第三节 DNA聚合酶,DNA polymerase主要功能：催化DNA的合成,真核生物五种：,、,、,、,、,原核生物三种：,DNA,聚合酶,I,II,和,III,1、活性：大肠杆菌DNA聚合酶I为单链多肽，相对分子质量为109,10,3,，有三种活性：,53 DNA聚合酶活性，53 外切核酸酶活性，35 外切核酸酶活性,。,交换反应：如果只有一种dNTP存在，3 5外切核酸酶活性将从3-OH端降解DNA，然后在该位置发生一系列连续的合成和外切反应，直到露出与该dNTP互补的碱基。,一、大肠杆菌聚合酶I,(1)利用大肠杆菌DNA聚合酶I的,53外切核酸酶活性,，可用切口平移法标记DNA，用作杂交探针。,方法：在Mg,2,存在下用DNaseI处理双链DNA模板，产生少量切口，在切口处，利用DNA聚合酶I的53外切核酸酶活性使切口沿53平移，同时产生的切口可作为DNA聚合酶I催化合成DNA的引物。合成过程中，标记的dNTP不断加入到DNA链上，可作为杂交探针。,2、大肠杆菌DNA聚合酶I的用途,(2)用于cDNA克隆中第二链合成,利用聚合酶活性。但已被淘汰，改用Klenow酶或反转录酶。,(3)对3突出末端的DNA作末端标记,利用交换反应。现改用T4或T7 DNA聚合酶。,2、大肠杆菌DNA聚合酶I的用途,二、Klenow DNA聚合酶,是大肠杆菌DNA聚合酶I经蛋白酶裂解后，从全酶中,除去53外切酶活性,的肽段后的大片段肽段，其聚合活性和35外切酶活性不受影响，相对分子质量为76,10,3,。,可利用基因工程生产。,(1)补平DNA的3凹端。(利用DNA聚合酶活性，要加足够的dNTP，如带标记，则可进行末端标记),(2)抹平DNA的3凸端。(3-5外切核酸酶活性，切除3凸端，要加足够的dNTP。T4和T7 DNA聚合酶可替代),(3)通过置换反应对DNA进行末端标记,(4)随机引物标记(聚合酶活性),(5)其他用途，如测序，cDNA合成第二链。,Klenow DNA聚合酶作用,三、T4噬菌体 DNA聚合酶,T4 phage DNA polymerase来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，,相对分子质量为114,10,3,，活性与Klenow DNA聚合酶相似，,但其35外切核酸酶活性强200倍，且不从单链DNA模板上替换引物，常用于诱变反应。,四、T7噬菌体 DNA聚合酶,来源于T7噬菌体感染的大肠杆菌，是由两种紧密结合的蛋白质形成的复合体，一种是噬菌体基因5编码的蛋白，另一个是宿主细胞的硫氧还原蛋白。,活性与T4噬菌体DNA聚合酶和Klenow DNA聚合酶相似，但其35外切核酸酶活性为Klenow DNA聚合酶1000倍，可替代T4噬菌体DNA聚合酶功能并可用于模板的引物延伸。,五、耐热 DNA聚合酶,在高温下具有活性的DNA聚合酶，来自嗜高温的细菌，主要用于PCR反应。,Taq DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Pwo DNA聚合酶和Tth DNA聚合酶。,六、反转录酶,(reverse transcriptase),依赖于RNA的DNA聚合酶，,有53合成DNA活性，,无35外切酶活性。,来自,AMV,(禽成髓细胞瘤病毒),和,Mo-MLV,(Moloney鼠白血病病毒，又称M-MuLV)。,具有53聚合酶活性和很强的,RNase H,活性(,特异性水解DNA:RNA杂交链上RNA链的磷酸二酯键，产生5核苷酸，该酶对单链的核酸、双链DNA或双链RNA没有作用)。,cDNA合成起始：引物和mRNA模板杂交体可成为RNase H的底物，模板的降解和cDNA的合成相竞争。,反应终止:RNase H可在正在增长的 DNA3端切割模板，抑制cDNA的合成,。,AMV反转录酶,RNase H缺陷型莫洛尼氏鼠白血病病毒(M-MuLV)反转录酶是一种RNA介导的DNA聚合酶。,该酶能以RNA(合成cDNA时)或单链DNA做模板由引物起始合成一个互补的DNA链。RNase H活性的缺失增强了该酶合成长链cDNAs的能力。,M-MuLV反转录酶,反转录酶的活性,5,3DNA,聚合酶活性,(,需,Mg,2+,),，即以,RNA,或,DNA,为模板及带,3-OH,的,RNA,或,DNA,引物合成,DNA,。,5,3,和,3,5,外切核酸酶活性，产生含,5,磷酸及,3-OH,的长,4,20,个碱基的核苷酸。,无,3,5,外切核酸酶校正作用，在高浓度,dNTP,等条件下每,500,个碱基会有一个错误的掺入。,七、末端转移酶,(terminal ransferase),来源于小牛胸腺，是存在于前淋巴细胞及分化早期的类淋巴样细胞内的一种DNA聚合酶，不依赖于模板的DNA聚合酶。,在2价阳离子存在下，末端转移酶催化dNTP加于DNA分子的3-OH端。若dNTP为T或C，首选Co,2,，若dNTP为A或G，首选Mg,2,。,可在cDNA或载体的3末端加同聚尾，便于克隆，也可用标记的rNTP、dNTP或ddNTP来标记DNA片段的3末端。,第四节 其他分子克隆工具酶,包括：SP6噬菌体RNA聚合酶、T4噬菌体RNA聚合酶、T7噬菌体RNA聚合酶。,活性：识别DNA中各自特异的启动子序列，并沿此DNA模板起始RNA的合成，无需引物。,用途：体外合成RNA分子，表达外源基因。,一、依赖于DNA的RNA聚合酶,二、连接酶(ligase),1.T4 DNA连接酶,催化DNA5磷酸基与3羟基形成磷酸二酯键，反应底物为黏端、切口、平末端的RNA或者DNA。,2.大肠杆菌DNA连接酶,需NAD,+,的参与，作cDNA克隆时，不会将RNA连接到DNA，不连接RNA。,3.Taq DNA连接酶,在两个核苷酸之间进行连接反应，同时必须与另一DNA链形成杂交体，相当于连接双链DNA中的缺口，作用在45-65,，需NAD+,主要用于在PCR扩增中引入寡核苷酸。,二、连接酶(ligase),4.T4 RNA连接酶,可以催化单链DNA或RNA的5磷酸与另一单链DNA或RNA的3羟基形成共价连接，用于标记RNA的3末端、单链DNA或RNA的连接等。,二、连接酶(ligase),三、T4多核苷酸激酶,T4 polynucleotide kinase 是一种磷酸化酶，可将ATP的,-磷酸基团转移至DNA或者RNA的5末端:,1.正反应：将ATP的-磷酸基团转移至无磷酸的DNA的5末端，用于对缺乏5磷酸的DNA进行磷酸化。,2.交换反应：在过量ATP存在的情况下，将DNA的5端磷酸转移给ADP,然后DNA从ATP上获得-磷酸而重新磷酸化。,四、碱性磷酸酶,Calf intestinal alkaline phosphatase,简称CIP或CIAP，,催化除去DNA或RNA-5磷酸的反应，,通过去除5磷酸基团，可防止DNA片段自连，或标记前去除DNA或RNA的5磷酸。,五、核酸酶,BAL31,核酸酶,(3,外切核酸酶活性,),S1,核酸酶,(,降解单链,DNA,或,RNA),绿豆核酸酶,(,降解单链,DNA,或,RNA),RNase,A(,去除,DNA,样品中的,RNA),DNase,(,降解双链或单链,DNA),外切核酸酶,(,在,dsDNA,3,羟基逐一去除单核苷酸,),核糖核酸酶,H(,水解,DNA:RNA,上,RNA,上的磷酸二酯键,),RNase,One(Promega,公司开发在所有,4,个碱基处切割磷酸二酯键,),六、核酸酶抑制剂,RNase inhibitor为RNase的非竞争性抑制剂，以非共价方式结合在RNase A类的酶上，其活性需要DTT。,主要应用于cDNA合成的反应中，如RT-PCR。,七、琼脂糖酶,Agarase是一种琼脂糖水解酶，可将琼脂糖亚单位(新琼脂二糖)水解为新琼脂寡糖。,用于从低熔点琼脂糖凝胶中分离纯化大片段DNA或RNA片段。对热很稳定，反应时不需要缓冲液。,八、DNA结合蛋白,1.单链DNA结合蛋白(single strand binding protein,SSB),与单链DNA结合，可以消弱链内二级结构的稳定性，从而加速互补多核苷酸的重新退火，并通过消除阻碍DNA聚合酶前进的链内二级结构，提高聚合酶的持续作用能力。,2.RecA蛋白,来自大肠杆菌，与重组有关，可与单链DNA结合，还可促进dsDNA对同源ssDNA的吸收作用，是一个依赖于DNA的ATP酶,3.拓扑异构酶,主要来自小牛胸腺，通过瞬时破坏并再生磷酸二酯键，解除共价闭环dsDNA中的超螺旋。,八、DNA结合蛋白,九、其他酶,1.蛋白酶K(Proteinase K)。,是具有高活性的丝氨酸蛋白酶，由霉菌产生。可以水解肽键，尤其适合水解羧基末端至芳香族氨基酸和中性氨基酸之间的肽键，能快速水解细胞裂解物中的DNA酶和RNA酶，有利于DNA和RNA的纯化。,2.溶菌酶。,是一类水解细菌细胞壁中聚糖的酶，用于破碎细胞。,作业及思考题,1.限制性内切酶可划分为哪几个类型，各有何特点？,2.DNA聚合酶有哪些，分别有哪些作用？,