分子诊断在移植配型中的应用.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,分子生物学检验技术在移植配型中的应用,第一节 分子生物学检验在移植配型中的应用,HLA的分子生物学分型,有两位在某医院进行了肾脏移植手术的患者：一位是张某，女，52岁，另一位是李某，男，25岁，手术前均为经透析治疗且身体状况良好的尿毒症病人，张某的移植肾来自尸肾，李某的移植肾来自其母亲，移植术前两人都抽血进行了一系列,组织配型,项目检验，其中一项HLA基因分型检测结果显示，张某与供者HLA配型不符，血型一致；李某与其母亲HLA配型四点相合，两点错配，血型一致。但由于肾源缺乏，且张某家属移植手术意愿强烈，张某和李某一样都进行了移植手术；,张某术后2周出现移植区胀痛、少尿，血液中尿素氮升高、补体水平下降、血小板减少，经医生给予适当的免疫抑制剂治疗后缓解；李某术后植入肾功能良好，没有出现上述类似张某的情况。一年后，张某因多次发生上述移植排斥反应导致肾功能完全丧失而死亡，李某植入肾功能正常，身体状况良好。,以上介绍了一个,在器官移植中供受者HLA的基因配型是否符合对术后移植排斥反应是否发生及受者存活率影响,的典型例子，帮助医生在进行器官移植手术前一定要依据供受HLA是否匹配谨慎决定移植手术是否进行。供受双方HLA配型良好且受者为直系来源，移植手术成功率高，排斥反应轻或不发生，受者存活率高。,移植,(transplantation):,指用自体或异体的正常细胞、组织或器官置换病变的或功能缺损的细胞、组织与器官，以维持和重建机体生理功能的治疗方法。,移植物,（,graft,）,供者,（,donor,）,受者,（,recipient,）,移植排斥反应,（,graft rejection,）,一、移植相关概念,被移植的细胞、组织、器官称为,移植物,（graft）,移植物的提供者称为,供者,（donor）。,移植物的接受者称为,受者或宿主,（recipient or host）。,所植入的移植物能否被受者接受，与供、受者的遗传背景密切相关。如果二者之间的遗传背景存在差异，植入的移植物一般都会发生炎症反应甚至坏死，称为,移植排斥反应,（graft rejection）。,目的：,救治末期器官衰竭、恶性血液病、肿瘤以及某些遗传病。,要求：,尽可能让移植物能在受体体内生存或暂存常时间。,问题：,排斥反应。,移植的目的和要求,自体移植：,指移植物取自受者自身。,同种,同型,移植：,指遗传基因型完全相同或基本近似个体间的移植。,同种异型移植：,也称同种异基因移植（allogeneic transplantation）指同种内遗传基因不同的个体间进行的器官移植，,临床移植多属此类型,。,异种移植：指不同种属个体间的移植。,二、移植排斥反应发生的机制,移植排斥反应的本质属于,特异性免疫应答,，引起移植排斥反应的抗原称为移植抗原或组织相容性抗原。在实质器官移植中，宿主对供者器官产生的免疫排斥反应称为,宿主抗移植物反应,（host versus graft reaction,HVGR）,而在骨髓、造血干细胞移植中，移植物中的淋巴细胞可识别宿主抗原，进而攻击宿主靶组织产生排斥反应，称为,移植物抗宿主反应,（graft versus host reaction,GVHR）。,异种之间的移植,无一例外地要失败；,同一种系内不相关的个体之间的移植常常要失败；,自体移植总是能成功；,同种异体的受体对首次移植物排斥时间较长，但再次接受同一供体的移植物，则迅速被排斥；,受体与供体间的血缘关系愈近，移植愈可能成功。,（一）移植排斥反应的规律,有关排斥反应的研究,首次植皮第5天 首次植皮第12天 再次植皮第5天,宿主抗移植物反应,(host-versus-graft Reaction,HVGR,),，见于一般器官移植，包括超急性、急性、慢性排斥反应,移植物抗宿主反应,(,hraft,-versus-host Reaction,GVHR),，,主要发生在骨髓移植和其他免疫细胞移植,（二）同种异型移植排斥的分类及效应机制,超急性排斥反应,（,hyperacute,rejection,）,指移植器官与受者的血管接通后立即或,1,2,天内发生的排斥反应,发生时间,移植器官与受者血管,接通后数分钟至,1,2,天内发生,1.超急性排斥反应,病理变化,血管内凝血缺血、变性和坏死,发生机制,以体液免疫为主，,受者体内预存供者的抗体,抗,ABO,血型抗原的抗体,抗,HLA,抗原的抗体,抗,VEC(,血管内皮细胞,),抗原的抗体,急性排斥反应,（,acute rejection,）,指在移植后数天至两周左右出现的免疫排斥反应，一旦发生进展迅速,发生时间,移植后数天至,2,周左右出现，,80%,90%,发生于移植后一个月内,2.急性排斥反应,病理变化,急性体液性排斥反应,血管内皮细胞损伤为主要表现的急性血管炎,急性细胞性排斥反应,实质细胞的坏死并伴有大量淋巴细胞、,M,浸润,发生机制：,以细胞免疫为主,移植物血管损伤,针对血管内皮细胞表面同种异型抗原的,IgG,抗体,补体依赖的细胞毒作用,实质细胞损害,CD4,+,Th1,介导的迟发型超敏反应,CD8,+,Tc,直接杀伤表达同种异型抗原的移植物细胞,慢性排斥反应,（,chronic rejection,）,指发生于移植后数周、数月、甚至数年的免疫排斥反应,发生时间,移植后数周、数月、甚至数年发生,病理变化,间质纤维化，移植物内血管平滑肌细胞增生，血管硬化,3.慢性排斥反应,发生机制：,体液免疫和细胞免疫共同作用,（具体尚不完全清楚）,急性排斥反应细胞坏死的延续和结果,炎症性,CD4,+,T,细胞,/,M,相关的慢性炎症,非免疫学因素诱发组织器官的退行性变,移植排斥反应的分类和特点,类型,反应时间,反应机制,超急性,术后数分钟至几小时,受者体内事先存在的天然抗体,加急性,15天,T,淋巴细胞,急性,714天,T,淋巴细胞,慢性,数月至数年,抗体、补体、内皮细胞增生,移植物抗宿主反应,（,Graft-versus-host reaction,，,GVHR,）,是由移植物中的抗原特异性淋巴细胞识别,宿主组织抗原而发生的一种排斥反应,发生条件,宿主与移植物之间组织相容性不合,移植物中含有足够数量的免疫细胞,宿主处于免疫无能或免疫功能严重缺陷状态,移植物抗宿主病,4.移植物抗宿主反应,移植物抗宿主病,移植物抗宿主病,GVHR,发生情况,一旦发生一般难以逆转，导致移植失败，严重,损伤患者，甚至死亡,主要见于：,骨髓移植（主要）、胸腺移植、脾移 植、新生儿接受大量输血,MHC(HLA),配型与移植排斥反应,0,20,40,60,80,100,120,0,6,12,24,36,术后时间,存活率,供者与受者相差一个,HLA,基因,供者与受者相差两个,HLA,基因,返回章目录,移植配型的基本原理,移植配型,(又称为,HLA配型,/,组织配型,):指在器官移植中检验,供受者,之间移植抗原（HLA）是否相配的一系列措施。目前主要检测的是ABO抗原系统和HLA抗原系统。,凡是由供、受者之间的等位基因差异而形成的多态性产物，均有可能作为组织相容性抗原，诱导机体产生免疫应答以清除“外来”的移植器官，引起移植排斥反应。因此，移植术前必须进行一系列检测，以尽可能选择与受者,组织相容性一致的供者,。,能引起移植排斥反应的抗原主要有人类主要组织相容性抗原（major histocompatibility complex,MHC）、次要组织相容性抗原、血型抗原和组织特异性抗原。目前主要检测的是,ABO抗原系统,和,HLA抗原系统。,人类白细胞分化抗原,（human leukocyte antigen,HLA,）是最重要的人类主要组织相容性抗原，本质上，供、受者间HLA型别差异是发生急性移植排斥反应的主要原因。,因此，在供体选择上科学运用移植配型技术提高供、受者间HLA位点匹配率是提高受者长期存活率的重要因素。,第二节,分子生物学检验在移植配型中的应用,HLA,的分子生物学分型,一、,HLA,遗传学基础,Human leucocyte antigen,人类白血病抗原,一、HLA与器官移植,基本概念,组织相容性,（,histocompatibility,）,器官或组织移植时供者与受者相互接受的程度，不相容就会出现,排斥反应,（rejection），诱导排斥反应的抗原称为,组织相容性抗原,，也称为,移植抗原,。,主要组织相容性抗原,（,MHA,）,主要组织相容性抗原,Major,histocompatibility,antigen,次要组织相容性抗原,人类白细胞抗原,HLA,Human leukocyte antigen,其中与移植排斥有关的主要为,HLA-,类和,类抗原。,主要组织相容性复合体,（,MHC,）,编码MHA(在人为HLA)的基因是一组呈高度多态性的基因群，集中分布于染色体上的特定区域，称为,主要组织相容性复合体,（,major histocompatibility complex,，,MHC,），MHC编码的产物称为,MHC分子,。,抗原,免疫系统 抗原肽MHC/分子复合物,免疫应答 CD4,+,/CD8,+,T细胞,（细胞免疫、体液免疫）,抗原性异物排除,MHC分子为T细胞分化发育所必需,MHC分子为免疫应答的启动和调节所必需,(一)MHC/HLA的基因组成,人类的,MHC,又称为,HLA,基因复合体,，位于第,6,对染色体的短臂,2,区,1,带,3,小带（,6p21.3,）,上，约,4000kb,。,根据编码分子的功能和分布的不同，可将,整个复合体的基因分成三类,：,类、,类和,类基因。,HLA,基因的分类,分类,基因座位,类基因,HLA-A -B -C,HLA-E -F -G -H -X,类基因,HLA-DP -DQ -DR,HLA-DN -DO -DM,类基因,位于和类基因之间主,要编码某些补体和炎症因,子（如：,C4A,，,C4B,，,C2,，,Bf,等补体组分）,HLA抗原分布,HLA-I,类抗原,分布于有核细胞表面；,HLA-II,类抗原,主要表达在活化的,M,、,B,细胞、树突状细胞等抗原提呈细胞，血管内皮细胞及活化的,T,细胞表面。,HLA-III,主要是一些补体成分：如,C2,、,C4,、,Bf,等。,HLA,抗原命名（第12届国际会议）,HLA-A,HLA-B,HLA-C,HLA-DR,HLA-DQ,HLA-,DP,A1,B5,B78,Cw1,DR1,DQ1,DPw1,A2,B7,B47,Cw2,DR103,DQ2,DPw2,A203,B703,B48,Cw3,DR2,DQ3,DPw3,A210,B8,B49(21),Cw4,DR3,DQ4,DPw4,A3,B12,B50(21),Cw5,DR4,DQ5(1),DPw5,A9,B13,B51(5),Cw6,DR5,DQ6(1),DPw6,A10,B14,B5102,Cw7,DR6,DQ7(3),A11,B15,B5103,Cw8,DR7,DQ8(3),A19,B16,B52(5),Cw9(w3),DR8,DQ9(3),A23(9),B17,B53,Cw10(w3,),DR9,A24(9),B18,B54(22),DR10,A2403,B21,B55(22),DR11(5),A25(10),B22,B56(22),DR12(5),A26(10),B27,B57(17),DR13(6),A28,B2708,B58(17),DR14(6),A29(19),B35,B59,DR1403,A30(19),B37,B60(40),DR1404,A31(19),B38(16),B61(40),DR15(2),A32(19),B39(16),B62(15),DR16(2),A33(19),B3901,B63(15),DR17(3),A34(10),B3902,B64(14),DR18(3),A36,B40,B65(14),DR51,A43,B4005,B67,DR52,A66(10),B41,B70,DR53,A68(28),B42,B71(70),A69(28),B44(12),B72(70),A74(19),B45(12),B73,A80,B46,B75(15),B76(15),B81,B77(15),Bw4,Bw6,注：括号中为宽型抗原,HLA基因命名方法,为：HLA+连字符（）+基因所属座位名+星号（*）+数字编号。如，HLA-A*0201代表HLA-A 座位0201基因，HLA-DRB1*0101代表HLA-DRB1座位0101基因。,HLA命名方法,HLA血清学命名,方法为：HLA+连字符（）+基因所属座位名+数字编号。如HLA-A3，HLA-DR4。,血清学命名中的数字编号与基因命名法数字编号的前两位相对应,，例如，HLA-A3的数字编号相对应的基因命名中的数字03，凡是HLA-A 座位基因的前两位数字是03者，其表达的产物都是HLA-A3抗原，都能够与HLA-A3抗体结合。因此，血清学分型是同一分子的，它们的编码基因不一定相同。例如至少有17个基因（HLA-A*02010217）的编码产物为HLA-A2抗原。,HLA,命名,历年发现HLA抗原和基因的情况,（二）HLA的遗传特点,1,单倍型遗传,haplotype,由于一条染色体上,HLA,各位点的距离非常近，很少发生同源染色体之间的交换，因此亲代的,HLA,以单倍型为单位将遗传信息传给子代。,A,B,a,b,G,H,g,h,A,B,G,H,A,B,g,h,a,b,a,b,G,H,g,h,（1）,（2）,（3）,（4）,全国高等医药院校教材-分子诊断学,2,共显性遗传,共显性,（,co-dominance,）是指某位点的等,位基因均能同等表达，二者的编码产物都可在细胞表面检测到。,多数个体的HLA位点都是,杂合子,，但当父亲和母亲在某位点上具有相同的等位基因时，其子代的这个位点就成为,纯合子,。,HLA复合体中每一个等位基因均为共显性，从而大大增加了人群中的HLA表型的多样性，达到10,8,数量级。因此除了同卵双生者外，无关个体间HLA型别完全相同的可能性极小。,A2,A10,B40,B16,A1,A2,B8,B35,HLA molecule：A1，A2，B8，B35,甲,甲,乙,乙,HLA molecule：A2，A10，B40，B16,HLA,共显性表达,3连锁不平衡,理论上，一个,HLA,位点的等位基因与另一,个或几个位点的等位基因在某一单倍型出现的频率应等于各自频率的乘积。然而实际情况是，在不同的地区或不同的人群，某些基因相伴出现的频率特别高，这种现象称为,连锁不平衡,。,已经发现某些疾病的发生与,HLA,复合体中某些特定的等位基因密切相关。,器官移植配型标准,最新的HLA命名已包括300种以上的类和350种以上的类等位基因，其中经典的HLA-2A、HLA-2B和2DR抗原由于与造血干细胞移植和器官移植的效果密切相关而被称为“移植抗原”。,目前国际上通用的器官移植配型标准是HLA-2A、2B和2DR,六抗原无错配标准,（zero HLA-2A,2B,2DR antigen mismatch,0 Ag MM）。最佳的HLA配型为HLA-2A、2B和2DR六抗原分型全相合。,在,肾移植,中，I类抗原主要影响受者长期存活率，尤以,HLA-B抗原,最重要，II类抗原对受者的长期和短期存活率均有重大影响，以,HLA-DR抗原,最重要；,HLA配型与移植效果最为密切的是,骨髓移植,，因移植物中存在大量的淋巴免疫细胞可识别宿主抗原，进而攻击宿主靶组织产生移植物抗宿主反应（graft versus host reaction,GVHR），且GVHR不易被免疫抑制剂所控制，故对HLA配型的要求非常高。,骨髓移植必须有合适的供者才能进行,，一般,先在受者的同胞中,寻找，与受者六个检测位点全相合的为首选，其次从父母、子女或近亲及最后从血缘无关志愿者中寻找。而供、受者间良好的配型必须建立在正确的HLA分型基础上，因此应用合适的移植配型技术对供、受者进行快速、准确地HLA分型是决定器官移植结局的重要环节。,理论上说，同胞兄弟姐妹中有,1/4,的机会,HLA,配型,完全相合,；子女与父母之间只有一半,HLA,抗原相同，医学上叫做,半相合,，通常不能,相互移植。所以,骨髓移植主要在同胞兄弟姐妹之间,进行。,常见的,HLA,分型，在,300,500,人就可以找到相同者，少见的,HLA,分型可能是万分之一的机率，而罕见的就要到几万甚至几十万的人群中寻找。,寻求与受者MHC相配的供者组织或器官,1),ABO血型相容试验：,2),淋巴细胞毒交叉试验（MLR）：,+不宜移植,受者血清+供者淋巴细胞 -可行,3),HLA定型或配型试验,非家庭配型：表现型相同,MHCII(HLA-DR)配合优于MHCI类,