免疫组化专业知识讲座.pptx

,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,第一节 免疫组化结果判断标准,免疫组化结果判断标准概括起来有以下几点：,免疫组化专业知识讲座,第1页,必须同时设对照染色,。没有对照染色免疫组化染色结果是不可信。,抗原表示必须在特定部位,。如,LCA,应定位在细胞膜上；,CK,应定位在细胞浆内；,PCNA,及,p53,蛋白应定位在细胞核内；,EMA,应定位在细胞膜上，等等。不在抗原所在部位阳性着色，一概不能视为阳性。,免疫组化专业知识讲座,第2页,阴性结果不能视为抗原不表示。,因为检测方法灵敏度有高低之分，有时可因染色方法灵敏度不够，而造成阴性反应，判断时应注意。,免疫组化专业知识讲座,第3页,尽可能避开出血、坏死及切片刀痕和界面边缘细胞阳性表示，,尤其是酶免疫标识。因为这类阳性着色多系内源干扰，或系人为原因所致。,免疫组化专业知识讲座,第4页,对免疫组化标识结果意义不能绝对化，,应结合临床资料、,X,线等影像学及试验结果综合分析。,免疫组化专业知识讲座,第5页,第二节,对照染色设计,免疫组化专业知识讲座,第6页,(,一）对照染色目标,设对照目标是为了排除假阴性和假阳性。假阴性原因主要有三：,组织处理不妥，抗原丢失过多或被遮蔽；抗体失活、效价过低或稀释度不适当（主要指一抗，即特异性抗体）；染色步骤遗漏及差错，或显色剂选择、缓冲液,pH,和离子强度不妥等。,免疫组化专业知识讲座,第7页,假阳性均系由各种原因造成非特异着色所致，原因主要有：,自发荧光或内源酶等干扰；抗体试剂不纯,(,尤其是一抗）；操作失误，如污染、切片干枯或显色剂操作不妥等；,Fc,受体干扰，等等。,免疫组化专业知识讲座,第8页,（二）对照种类及其选取目标,对照染色大致可分为阳性组织对照、阴性组织及阴性试剂对照和本身对照四大类：,免疫组化专业知识讲座,第9页,阳性组织对照,指用已证实含有靶抗原同源及不一样源组织切片或细胞涂片与待检试验切片同时作一样处理和免疫染色组织对照。正确结果应展现阳性，目标是为了证实所用免疫组化染色流程有效性，排除假阴性可能。,免疫组化专业知识讲座,第10页,阴性组织对照,指用已证实不含靶抗原同时处理和免疫标识染色组织对照。正确结果应为阴性，目标是除外假阳性。,免疫组化专业知识讲座,第11页,阴性试剂对照,是指用于证实在免疫组化染色中所用试剂，尤其是特异性抗体试剂有效性和可靠性而所设置同时免疫染色对照，包含有：,空白对照；替换对照；吸收试验和抑制试验，等。目标在于除外假阳性和证实所用免疫组化试剂及其技术方法有效性和待检试验切片免疫标识阳性结果可靠性。,免疫组化专业知识讲座,第12页,空白对照,指以缓冲液（,PBS,、,TBS,等）取代第一抗体（主要，必要时还可做第二抗体及桥联抗体空白取代），其它各步不变试剂对照染色，结果应为阴性。,免疫组化专业知识讲座,第13页,取代对照,指以所用方法第一抗体同源动物正常血清，或与本试验无关抗体,(,靶生物缺如,),取代第一抗体，其它步骤不变试剂对照染色，结果应为阴性。,吸收试验,是指用事先经过量抗原吸收第一抗体上清液取代第一抗体，其它步骤不变免疫染色试剂对照。结果应是阴性或阳性着色显著减弱（吸收不全时）。,免疫组化专业知识讲座,第14页,抑制试验,是指用标识抗体和未标识抗体（能够是一抗，也能够是二抗或桥抗体）二者混合物作试剂，其它步骤不变免疫组化染色试剂对照，结果其阳性着色应成百分比减弱（等量或,1,：,9,）。此试剂对照多用于直接法。,免疫组化专业知识讲座,第15页,这类阴性试剂对照,选取标准,是：空白对照不能省，其它对照在预试验中应尽可能多做，尤其是应用新抗体试剂；对照必需与试验片同时进行染色；对照结果应附合要求。,免疫组化专业知识讲座,第16页,本身对照 是指在同一标识切片上本身组织成份阴性背景对照。,即与靶抗原阳性反应细胞或成份相邻阴性背景结构显色，结果应为阴性或着色较浅，需与阳性着色成份呈鲜明对比。目标在于排除内源性干扰产生假阳性和因抗原弥散移位造成错误结果。,免疫组化专业知识讲座,第17页,第三节,非特异染色,免疫组化专业知识讲座,第18页,非特异染色是指免疫组化染色过程中产生非靶抗原呈色结果，属假阳性，又称背景着色，能严重干扰免疫组化染色结果正确判断，应尽力防止或减轻。其原因包括免疫组化染色流程各个步骤，可来自：,免疫组化专业知识讲座,第19页,内源性干扰,(,自发荧光、内源酶、内源性生物素等,),；试剂污染,(,质量差，交叉反应，,Fc,受体干扰等,),；组织处理不妥,(,组织固定不及时或固定不良所造成抗原弥散移位、洗涤不充分所造成游离试剂残留等,),。,免疫组化专业知识讲座,第20页,纠正方法视原因而异，可在预试验基础上，采取有针对性纠正对策，即对症下药,(,详细纠正方法不展开讲了，同学们能够自己阅读讲义,p123-126),。,免疫组化专业知识讲座,第21页,第四节,阳性标识形态特征和判断,免疫组化专业知识讲座,第22页,免疫组化标识含有一定形态特点，若能熟练掌握则有利于对免疫组化标识结果正确判断。特点包含定性、定位和定量三方面。,免疫组化专业知识讲座,第23页,免疫显色强度和阳性细胞密度是定性定量指标，实际工作中常采取强度和密度结合方法综累计量，与抗原含量相关；阳性细胞着色形态及组织分布特点主要是定位指标，与功效相关。,免疫组化专业知识讲座,第24页,一、阳性标识免疫特征：分,弱,(+),、中,(+),、强,(+),三级。免疫荧光法（,FITC,为例）则表现为浅绿色荧光、显著绿色荧光和亮绿色刺眼荧光；,免疫组化专业知识讲座,第25页,免疫酶标识（,HRP-DAB/H,2,O,2,）则表现为,淡黄色细颗粒、棕黄色颗粒和褐黄色粗颗粒,，后者刺眼易见。普通图片照像，标准上多取强阳性区域。,免疫组化专业知识讲座,第26页,二、阳性标识细胞学特征,（以,HRP-DAB/H,2,O,2,为例）可分为,胞膜型；胞核型；胞质,(,浆,),型；微绒毛型和复合型,（胞膜,-,胞质兼有，胞核,-,胞质兼有，或微绒毛,-,胞质兼有）等五种阳性细胞类型。这与抗原所在部位相关联，但应注意排除因组织固定不好引发抗原弥散假象，尤其是复合型图像。,免疫组化专业知识讲座,第27页,免疫组化专业知识讲座,第28页,免疫组化专业知识讲座,第29页,免疫组化专业知识讲座,第30页,免疫组化专业知识讲座,第31页,三、阳性标识组织学特征,（以,HRP-DAB/H,2,O,2,为例）免疫组化染色阳性细胞在组织中分布排列形式能够有以下,7,种：,局灶型；弥漫型；片块型；网状型；腺管型；腔缘型和菊团型,，等。这主要取决于抗原抗体复合物在细胞内分布和阳性细胞在组织内群体分布特点。,免疫组化专业知识讲座,第32页,四、阳性标识强度特征,依照细胞阳性着色程度（抗原含量），可分为弱阳性（,+,）,1,分；中等阳性（,+,）,2,分；强阳性（,+,）,3,分。依照阳性细胞数量，可分为：弱阳性（,+,，指阳性细胞总数在,25%,以下）；,免疫组化专业知识讲座,第33页,中等阳性（,+,指阳性细胞总数在,25%49%),；强阳性（,+,，指阳性细胞总数在,50%,以上,),。当前多采取积分综累计量。计算公式为：（,+,）,%x1+,（,+,）,%x2+,（,+,）,%x3,；总数值,1.5,者为,(+),。最少随机观察,5-10,个,HPF,。,免疫组化专业知识讲座,第34页,第五节,染色失败可能原因,免疫组化专业知识讲座,第35页,免疫组化染色基本要求有二：,试验切片阳性抗原定位准确，呈色鲜明，背景着色浅或无，二者比值应大于,1,（阳性,/,背景）；对照染色结果应附合要求。不然，所得试验结果都是错误，或为假阳性或为假阴性。,免疫组化专业知识讲座,第36页,假阳性是指试验切片呈阳性，阴性组织对照或,阴性试剂对照,也呈阳性结果，谓之假阳性。其原因与内源性干扰，试剂不纯，交叉反应等相关。,免疫组化专业知识讲座,第37页,假阴性是指试验切片呈阴性，,阳性组织对照,及阴性试剂对照也均呈阴性结果，谓之假阴性。其原因与组织处理不妥，组织细胞抗原丢失或试剂错误,(,如漏加、错加、失效、变质等,),操作失误等相关。,免疫组化专业知识讲座,第38页,对照结果判断：,表中,1,5,结果无效，,6,、,7,结果可靠,（）,（）,（）,（）,（）,（）,（）,检测标本含抗体，结果可靠,（）,（）,（）,7,检测标本不含抗体结合可靠,（）,（）,（）,6,非特异染色,（）,（）,（）,5,阳性对照不含定位抗原,（）,（）,（）,4,阴性对照内含定位抗原,(,)(,),（）,（）,3,非特异性染色,（）,（）,（）,2,抗体失活，操作有误,（）,（）,（）,1,结果判断,检测结果,替换对照,阴性对照,阳性对照,免疫组化专业知识讲座,第39页,染色失败原因：,均为阴性,均为弱阳性（除阴性对照）,背景染色过深,阳性对照好，待检标本弱阳性,阳性对照无背景，待检标本背景深,免疫组化专业知识讲座,第40页,判断标准：,试验设计,抗体选择,抗原定位性,抗原分布不均一性,免疫组化专业知识讲座,第41页,识别假阴性,抗原丢失或减弱,抗体失活,操作不妥,识别假阳性,抗原弥散,抗原异位表示,瘤细胞吞噬,病变中正常组织残留,抗体交叉反应,内源性物质着色,免疫组化专业知识讲座,第42页,